維生素AD3E針劑對圍產(chǎn)期奶牛乳蛋白表達的影響

張樂穎，王加啟，楊永新，卜登攀，李珊珊，魏宏陽

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京 100193；2.河北工程大學 農(nóng)學院，河北 邯鄲 056021)

圍產(chǎn)期是奶牛泌乳周期乃至一生中最為關鍵的時期.由于妊娠、分娩和泌乳的應激，易使奶牛處于免疫抑制狀態(tài)[1]，進而產(chǎn)后發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、乳房炎和胎衣不下等[2-4].通過補充維生素來緩解圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制，減少疾病發(fā)生，提高機體免疫力，國內(nèi)外學者對此做了大量研究.曹榮等[5]在奶牛產(chǎn)前日糧中添加維生素D3(V-D3)緩解了圍產(chǎn)期奶牛免疫球蛋白(Ig)的下降，提高了中性粒細胞含量.中性粒細胞是奶牛抵御乳房炎病原菌的第一道防線，是非特異性免疫系統(tǒng)最重要的細胞，添加V-D3后，中性粒細胞數(shù)量提高，表明日糧中添加V-D3提高了機體的非特異性免疫.何文娟等[6]在圍產(chǎn)期日糧中添加β-胡蘿卜素(V-A前體)，不僅提高了產(chǎn)乳量，而且還降低了胎衣不下、子宮炎和乳房炎的發(fā)病率.產(chǎn)前一周，每毫升血清中的V-E含量每增加1 μg，胎衣不下的發(fā)生率將降低20%，V-A的含量每增加100 ng，臨床性乳房炎的發(fā)病率將降低60%[7].然而，迄今尚未有關于復合V-AD3E注射液對圍產(chǎn)期奶牛營養(yǎng)調(diào)控方面的報道.為此，筆者采用雙向電泳結合高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜的方法，從乳蛋白整體規(guī)模探索了復合V-AD3E 對圍產(chǎn)期奶牛乳蛋白表達的影響，現(xiàn)將結果報道如下.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及制備

于天津三元綠荷二牧牛場選取健康、體重接近、預產(chǎn)期相近的中國荷斯坦初產(chǎn)奶牛24頭，其中12頭在預產(chǎn)期前15 d注射V-AD3E 20 mL (每mL含V-A 50 000 IU、V-D325 000 IU、V-E 乙酸酯4.0 mg)，另12頭為對照組(不注射).奶牛以全混日糧(TMR)方式飼喂，日喂2次，擠奶3次，自由飲水.分別在產(chǎn)后第1天和第21天收集奶樣，按早、中、晚4∶3∶3比例混合后，取120 mL制備乳蛋白樣品.乳樣在4℃、3 000 g離心15 min，棄上層乳脂，收集清液即為牛乳蛋白.經(jīng)考馬斯亮藍G250進行蛋白定量后，－80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 2-DE

第一向等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳：采用膠內(nèi)溶脹法，將300 μg的乳蛋白樣品與350 μL水化上樣緩沖液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2 % IPG Buffer(pH3-10)，0.001%溴酚藍)混勻(漩渦振蕩5 min)，10 000 g離心2 min，吸取上清，均勻加入至聚焦盤中，進行等電聚焦.結束后，將膠條用2.0%DTT平衡緩沖液還原，2.5%碘乙酰胺平衡緩沖液烷基化[8]，然后進行12%SDS-PAGE垂直電泳，循環(huán)水浴溫度為12 ℃，程序設置為：1 W、30 min；2 W、1 h，最后48 W直到溴酚藍指示劑到達膠的底部.

1.3 凝膠染色和圖像分析

凝膠用考馬斯亮藍染色(0.12% G-250，10%(NH4)2SO4，10% H3PO4，20% Methanol)[9].Umax掃描儀采集圖像，Image Master 6.0軟件進行背景消減、斑點檢測、自動匹配.試驗重復3次.將注射組與不注射組凝膠圖譜以斑點染色強度和面積2倍量的變化為標準進行差異分析，檢測差異表達的蛋白斑點.

1.4 蛋白質(zhì)酶解

切去槍頭尖端，使其直徑約2 mm，選取差異表達的區(qū)域，分離后置于1.5 mL離心管中.先用超純水清洗2次，每次15 min，再向每管加入150 μL脫色液(50%乙腈＋50% 25 mmol/L碳酸氫銨)，室溫放置30 min，重復1次.抽真空離心干燥(Savant,Speed Vac Concentrator)30 min ，然后向干燥凝膠顆粒中加入 10 μL 20 ng/μL 測序級胰蛋白酶，37 ℃過夜.吸出酶解液，加入8 μL 2.5%三氟乙酸＋50%乙腈，30 ℃放置1 h，吸出的液體與前一次的合并，重復1次.

1.5 離子阱質(zhì)譜檢測

酶解肽混合物采用液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)(LCQ Deca XP plus，Thermo Finnigan)分析.上樣前，先用流動相 A(超純水＋0.1%甲酸)平衡色譜柱(C18, Milford, MA, USA)，再用流動相B(乙氰＋0.1%甲酸)線性梯度洗脫 120 min.樣品上樣量 20μL，流速 110 μL/min.質(zhì)譜全掃描范圍：m/z 400～2 000，MS/MS 數(shù)據(jù)依賴掃描 5次(噴霧電壓 3.2 kV，溫度160 ℃)，數(shù)據(jù)采集在正離子模式下運行.所獲數(shù)據(jù)用整合在質(zhì)譜儀上的Bioworks中的SEQUEST搜索NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫.檢索結果輸出后，采用Single threshold參數(shù)對數(shù)據(jù)庫結果進行篩選，當 Xcorr 分數(shù)為1.9、2.2、3.75時，相應電荷為＋1、＋2、＋3.

2 結果與分析

2.1 乳蛋白的差異表達檢測

由圖1可見，與不注射組第1天的凝膠圖譜相比，注射組第1天的乳蛋白圖譜上有5個蛋白點表達量上調(diào)(圖 1-A、B)；在第21天，注射組與對照組在蛋白表達上差異不明顯(圖1-C、D).

圖1 乳蛋白表達圖譜Fig.1 Analysis of expression protein patterns of bovine milk

2.2 差異表達蛋白的鑒定

經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜分析肽質(zhì)量，并用整合在質(zhì)譜儀上的Bioworks 軟件中的檢索軟件 SEQUEST搜索NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，差異表達蛋白主要對應于2種蛋白——免疫球蛋白G (IgG)和白蛋白，如表1所示.

表1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定初乳和常乳差異表達蛋白Table 1 Identification of differential expression protein from colostrum and milk by LC/MS/MS

3 小結與討論

牛初乳中的IgG和白蛋白絕大部分來自血液[10]，分娩前幾周由于乳房的膨脹、血管滲透性增加，使得血液中IgG 和白蛋白等進入乳腺[8,11].新出生的犢牛血清中幾乎沒有抗體[12]，因此犢牛對病原菌的抵抗主要依靠初乳提供的被動免疫.及時地讓犢牛吃上初乳很重要，因為反芻動物胎盤不允許母源抗體通過，而且犢牛的自身免疫系統(tǒng)需要數(shù)周甚至數(shù)月才能成熟[13].

有關維生素對機體的作用，前人作了很多研究.產(chǎn)前一個月，每周給奶牛注射 V-AD3E 1次(每次注射量：V-A 80 000 IU、V-D340 000 IU，V-E 20 mg)，可顯著降低胎衣不下的發(fā)生率，而且還可縮短分娩后再次妊娠的時間[14].Waller 等給瑞典東南部21個牛群中的圍產(chǎn)期奶牛每天補充V-E 乙酸鹽1 610 mg(從產(chǎn)前 4 周到產(chǎn)后2周)，顯著降低了犢牛出生后 24 h內(nèi)的死亡率[15].此外，給斷奶前小母牛補充V-ADE，顯著降低了腹瀉率[16].體外試驗表明，補充V-A 促進了幼齡動物臍帶血合成IgM的量和成年動物外周血單核細胞合成IgG的量[16].V-A及其代謝產(chǎn)物作為免疫增強劑，使抗體對依賴抗原的T細胞做出應答反應，促進淋巴細胞增值、抑制細胞凋亡[18].本試驗結果表明，V-AD3E聯(lián)合作用，上調(diào)了初乳中IgG和白蛋白等蛋白的表達，這不僅為飼喂初乳的犢牛提供了更好的免疫保護，也為犢牛腸道的正常發(fā)育和母牛乳房功能的正常發(fā)揮提供了必要保障.此外，還提高了處于免疫抑制階段母牛對疾病的抵抗力.

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