氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)法測(cè)定煙草生物堿的方法優(yōu)化

肖遂，周冀衡，楊虹琦，彭艷，柳立，尹光庭

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

煙草生物堿是評(píng)價(jià)煙草及其制品感官質(zhì)量的重要指標(biāo)[1].目前，中國對(duì)煙葉生物堿的組成含量研究還不系統(tǒng)，主要是由于其中的微量生物堿含量極低，運(yùn)用常規(guī)方法無法準(zhǔn)確檢測(cè)，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)法是解決這一問題的有效方法，該技術(shù)在煙草生物堿的分析測(cè)定中的應(yīng)用已有相關(guān)報(bào)道[2-5].但目前已有的方法在提取分離的相關(guān)技術(shù)參數(shù)上并無系統(tǒng)研究，存在不能確保煙葉生物堿各個(gè)組分完全提取和對(duì)含量極低的麥斯明檢測(cè)效果不理想等問題，需要優(yōu)化提取分離技術(shù)和測(cè)定方法的相關(guān)技術(shù)參數(shù)，建立起準(zhǔn)確、快捷、可靠的檢測(cè)方法.筆者對(duì)氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)法測(cè)定煙草生物堿的方法進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下.

1 材料與方法

1.1 材 料

供試煙葉為云南省大理彌渡樣品.

美國Aglent公司6850-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器；意大利Finnigan公司Trace GC ultra氣相色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器；MS條件：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，連接管溫度280 ℃，溶劑延遲3 min，采用全掃描方式(Scan)；升溫程序：初溫90 ℃，以15 ℃/min升至140℃，保持20 min，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min.GC條件：DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；氫火焰離子檢測(cè)器溫度280℃.載氣為高純氮(純度＞99.999%)，流速2.0 mL/min；不分流進(jìn)樣.升溫程序同上.

鄭州長城科工貿(mào)有限公司R201D-II旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KQ-100DE型數(shù)控超聲波(昆山市超聲儀器有限公司).

NaOH、CH2Cl2、無水硫酸鈉均為分析純?cè)噭?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿等標(biāo)樣均購于美國SIGMA公司，純度＞98%.

1.2 方 法

1.2.1 生物堿提取分離技術(shù)的優(yōu)化

(1)提取方法的正交優(yōu)化[6-7].樣品提取分離過程中NaOH溶液的濃度(A)、NaOH溶液的用量(B)、浸泡時(shí)間(C)和超聲時(shí)間(D)是影響被分析物是否被提取完全的主要因素.采用正交試驗(yàn)L9(34)(表1)法，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品置于100 mL帶塞三角瓶中，加10 μL喹啉(5 mg/mL)內(nèi)標(biāo)，按表1加入NaOH溶液，浸泡一定時(shí)間后超聲，超聲后離心取上清液，用CH2Cl2萃取3次，合并有機(jī)層，加少量無水硫酸鈉，放置冰箱中冷藏過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于 45 ℃水浴中將萃取液濃縮至1 mL，進(jìn)行GC分析，記錄選定的煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿和新煙草堿 5個(gè)組分的峰面積之和.正交試驗(yàn)結(jié)果采用 DPS V2.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.

(2)萃取溶劑體積的確定.在其他前處理?xiàng)l件不變的情況下，考察不同萃取溶劑體積(10、15、20、25、30 mL(萃取 3次))對(duì)萃取量的影響，進(jìn)行 GC分析，記錄選定的煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿和新煙草堿5個(gè)組分的峰面積之和.

1.2.2 GC-MS測(cè)定煙葉生物堿含量

(1)生物堿的定性與定量.采用 GC-EI/MS全掃描方式(Scan)對(duì)煙草生物堿進(jìn)行定性.內(nèi)標(biāo)法相對(duì)定量，由于新煙草堿無標(biāo)樣，利用保留時(shí)間與之相近的假木賊堿響應(yīng)因子定量.

(2)線性回歸方程及檢測(cè)限的確定.準(zhǔn)確量取煙堿24.75 μL溶于1 mL二氯甲烷，配成25 mg/mL的煙堿標(biāo)準(zhǔn)液；準(zhǔn)確稱取降煙堿25 mg溶于1 mL二氯甲烷，再量取80 μL溶于1 mL二氯甲烷，配成2 mg/mL的降煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別準(zhǔn)確稱取麥斯明、假木賊堿各25 mg溶于1 mL二氯甲烷，再各量取40 μL溶于1 mL二氯甲烷，配成1 mg/mL的麥斯明和假木賊堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.分別準(zhǔn)確移取上述煙堿、降煙堿、麥斯明和假木賊堿的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液80、500、40、200 μL，再定容至1 mL，配成混標(biāo)母液.取混標(biāo)母液 300、200、100、80、60、40、20、10 μL，各加入10 μL喹啉(5 mg/mL)內(nèi)標(biāo)，再定容至1 mL，制備成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.按色譜條件測(cè)定，以分析物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比(Y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)(μg/mL)進(jìn)行線性回歸；將逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣1 μL，以3倍基線噪聲作為檢出限.

(3)回收率及重現(xiàn)性試驗(yàn).將煙堿、降煙堿、麥斯明和假木賊堿的標(biāo)樣分別配制成高、中、低3個(gè)濃度添加到樣品中，樣品生物堿含量及添加標(biāo)樣量見表4.每個(gè)添加濃度重復(fù)5次，計(jì)算各生物堿的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以分別考察方法的準(zhǔn)確度和精密度.1.2.3 樣品測(cè)定

取已知煙堿含量(常規(guī)方法檢測(cè)[8])的樣品5份，煙堿含量為1.80%～4.05%，其含量范圍符合優(yōu)質(zhì)烤煙煙堿含量標(biāo)準(zhǔn)，每份樣品測(cè)定3次，記錄樣品中不同生物堿組分峰面積的RSD.

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿提取的最佳條件

正交試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的強(qiáng)弱次序?yàn)锽、C、A、D，較優(yōu)的水平組合為A4B2C3D3，即用2 mol/L的NaOH溶液40 mL，浸泡樣品3 h后再超聲提取1 h，得到樣品各組分的峰面積之和最大.

不同的萃取溶劑體積對(duì)萃取量的影響結(jié)果表明，當(dāng)萃取溶劑體積由10 mL增加到20 mL時(shí)，各生物堿組分峰面積之和隨著萃取溶劑體積的增加而大幅增加，而由20 mL增加到30 mL時(shí)各生物堿組分峰面積之和略有下降，這可能是由于萃取溶劑體積過大導(dǎo)致濃縮步驟對(duì)目標(biāo)成分造成少量損失.為確保各個(gè)組分提取完全，選取20 mL作為最佳的萃取溶劑體積.

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the orthogonal test

2.2 定性定量結(jié)果及檢出限

經(jīng)GC-MS分析鑒定，各生物堿的保留時(shí)間及匹配度見表2，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流圖(圖1)和樣品總離子流圖(圖2).線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表 2.結(jié)果表明：各生物堿呈現(xiàn)較好峰型，無重疊無拖尾，匹配度均達(dá)到定性要求，且當(dāng)煙堿、降煙堿、麥斯明和假木賊堿的質(zhì)量濃度分別為20～600、30～300、3.2～12.0、16～60 mg/L 時(shí)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

表2 各生物堿的定性定量分析結(jié)果Table 2 Qualitative and quantitative investigation of alkaloids

圖1 生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)液總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of standard samples

圖2 樣品生物堿總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of tobacco sample

2.3 回收率和重現(xiàn)性

回收率和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，各生物堿質(zhì)量濃度在5.1～14 650 μg/mL時(shí)，加標(biāo)回收率為88.5%～105.4%，RSD為2.4%～9.2%，說明本方法的重復(fù)性較好，準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求.

表3 方法的添標(biāo)回收率和精密度(n=5)Table 3 Recovery and precision of the method (n=5)

2.4 樣品的測(cè)定結(jié)果

由表4可知，5份樣品的煙堿占總生物堿含量平均為95.4%.微量生物堿的含量從大到小依次為新煙草堿、降煙堿、假木賊堿、麥斯明，其檢測(cè)的含量范圍和各組分含量所占比例與已有報(bào)道[9-11]基本一致.另外，同一樣品的 3次測(cè)定結(jié)果在不同組分的峰面積的RSD平均值小于9.6%，說明該方法能有效地應(yīng)用于生物堿含量差異明顯的煙葉樣品檢測(cè).

表4 煙葉樣品生物堿含量測(cè)定Table 4 The alkaloids content of flμe-cμred tobacco samples n=3

3 結(jié) 論

通過試驗(yàn)對(duì)影響超聲提取和有機(jī)溶劑萃取的幾個(gè)關(guān)鍵因素的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到的優(yōu)化條件是：用2 mol/L的NaOH溶液40 mL，浸泡樣品3 h后超聲提取1 h，再分別用20 mL二氯甲烷萃取3次，濃縮至1 mL進(jìn)GC-MS分離鑒定.樣品添加標(biāo)樣回收率測(cè)定的不同組分峰面積 RSD平均值小于9.2%，說明所建立方法的重現(xiàn)性較好.應(yīng)用優(yōu)化的分析技術(shù)對(duì)煙堿含量為 1.80%～4.05%的 5份樣品進(jìn)行生物堿組成和含量分析，證明該技術(shù)可較好地檢測(cè)出生物堿含量差異明顯的煙葉樣品中的煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿和新煙草堿，RSD平均值小于9.6%.該方法具有檢測(cè)煙草生物堿靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，且操作簡便，能確保煙葉生物堿各個(gè)組分提取完全，可有效應(yīng)用于煙草生物堿的分析檢測(cè).

[1]明寧寧，郭俊成 ，劉強(qiáng) ，等. 煙草中生物堿的提取和分析方法研究進(jìn)展[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2007，13(6)：64-70.

[2]侯英，楊偉祖，陳章玉，等. 應(yīng)用SPME與GC/MS測(cè)定煙葉中的生物堿[J]. 云南化工，2003，30(2)：34-37.

[3]許燕娟，白長敏，鐘科軍，等. 氣相色譜/質(zhì)譜分析煙草中的主要生物堿[J]. 分析化學(xué)，2006，34(3)：382-384.

[4]丁麗，盛良全，童紅武，等. 溶劑萃取-毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定煙草中主要生物堿[J]. 分析化學(xué)，2004，32(9)：1161-1164.

[5]廉蕓蕓，王允白，邱軍，等. 不同產(chǎn)區(qū)烤煙中主要生物堿含量和組成比例分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2008，29(4)：6-9.

[6]侯英，楊蕾，王保興，等. 應(yīng)用攪拌棒吸附萃取-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜分析煙用香料的化學(xué)成分[J]. 色譜，2006，24(11)：601-605.

[7]慕俊澤，李宣，張斌，等. 氣相色譜法測(cè)定紡織品中的三種有機(jī)磷阻燃劑[J]. 色譜，2007，25(5)：389-391.

[8]史宏志，煙草生物堿[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：40-42.

[9]王瑞新. 煙草化學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：52-56.

[10]高志強(qiáng)，鄧小華，周清明，等. 湖南烤煙生物堿含量及其相關(guān)性分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，34(3)：288-293.

[11]周冀衡，肖志新，楊虹琦，等. 不同品種烤煙主要品質(zhì)和安全性指標(biāo)分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，34(6)：640-642.