利用原子力顯微鏡觀察芥藍(lán)葉片氣孔

陳少雄，陳家楠，蔡繼業(yè)

(1.揭陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物系，廣東 揭陽(yáng) 522000；2.暨南大學(xué) 化學(xué)系，廣東 廣州 510632）

高等植物葉片氣孔的形態(tài)、數(shù)量以及分布與植物的生理功能關(guān)系密切[1]，不同種類的植物，氣孔的形貌各不相同，可以將氣孔作為鑒別植物種類的參數(shù)之一，張菊平等[2]發(fā)現(xiàn)可以利用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的周長(zhǎng)來(lái)鑒定辣椒植株是否屬于單倍體或是二倍體.

目前，觀察葉片氣孔形貌的儀器主要有光學(xué)顯微鏡[3-4]、掃描電鏡[5-6]、共聚焦顯微鏡[7-8]等.用普通光學(xué)顯微鏡觀察氣孔是最常用的方法，觀察氣孔的數(shù)量和分布簡(jiǎn)單易行，但是受光學(xué)衍射極限的限制，極限分辨率只能達(dá)300 nm左右，無(wú)法看清氣孔表面的細(xì)節(jié).利用掃描電鏡可以清晰地看到氣孔的形貌，但是樣品制作過(guò)程復(fù)雜且必須在真空中成像，而氣孔被觀察時(shí)已經(jīng)處于失活狀態(tài)，既無(wú)法觀察氣孔的動(dòng)態(tài)過(guò)程，圖像也會(huì)有一定程度的失真.

原子力顯微鏡AFM觀察植物葉片氣孔，制樣簡(jiǎn)單，分辨率可以達(dá)到10 nm，遠(yuǎn)高于環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM).可直接將樣品黏附于云母、石墨、玻片等平整的基底表面進(jìn)行掃描，還可以在近生理狀態(tài)下對(duì)樣品進(jìn)行成像.由于AFM的這些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已有很多研究應(yīng)用它來(lái)探討各種生物過(guò)程，但是目前尚未見(jiàn)到直接利用活體材料通過(guò)AFM觀察葉片氣孔超微結(jié)構(gòu)的報(bào)道.筆者采用AFM振蕩模式[9-10]研究芥藍(lán)葉片氣孔表面及其周圍的超微結(jié)構(gòu)，并對(duì)氣孔在溫度升高過(guò)程中的形態(tài)變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察.

AFM 是利用光杠桿原理產(chǎn)生的光束偏轉(zhuǎn)技術(shù)研制而成的[9].在一個(gè)對(duì)形變極為敏感的微懸臂(cantilever)的一端安裝納米級(jí)的針尖，掃描時(shí)樣品和針尖存在力的相互作用，使微懸臂產(chǎn)生形變，導(dǎo)致從針尖背面反射到四象限檢測(cè)器的激光束發(fā)生微弱變化，繼而產(chǎn)生電壓差，最后將這些電壓信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像.用于分析的模式有接觸模式(contact mode)和振蕩模式(tapping mode)兩種.使用接觸模式進(jìn)行掃描時(shí)，針尖與樣品相互接觸，所成圖像具有較高的分辨率，通常用來(lái)檢測(cè)樣品的物理屬性，由于剪切力的存在，對(duì)樣品有一定損傷，很少用于探測(cè)生物樣品.振蕩模式是靠聲學(xué)或磁力驅(qū)動(dòng)，針尖和樣品只有短暫接觸，作用力較小，常用于生物樣品成像[10].

1 材料與方法

選取新鮮芥藍(lán)葉片，上表皮朝上，用無(wú)菌蒸餾水沖洗兩遍后，切成2 cm×2 cm的小方塊，通過(guò)雙面膠將小方塊固定于蓋玻片上，將蓋玻片放置于AFM的樣品臺(tái)上留待觀察.

將蓋玻片置于 AFM(Cpresearch，Thermomicroscopes，USA)樣品臺(tái)上，利用監(jiān)視器將探針定位在葉片上任意平坦區(qū)域.樣品在Tapping模式下觀察，懸臂針尖曲率半徑為10 nm，力常數(shù)約為2.8 N/m，室溫下觀察，掃描速率1 Hz.AFM圖像僅經(jīng)過(guò)平滑處理(Thermomicroscopes，Proscan Image Processing Software Version 2.11軟件)，利用軟件的線分析功能，對(duì)圖像進(jìn)行剖面高度曲線的分析.

2 結(jié) 果

用AFM對(duì)樣品進(jìn)行大范圍的掃描，得到圖1-a所示掃描范圍為100 μm×100 μm的高度圖，高度圖以灰度值的高低表示物體高度的變化，灰度值越高(越接近白色)表示高度越高，灰度值越低(越接近黑色)表示高度越低，圖片正中間是一個(gè)張開(kāi)的氣孔，氣孔的周圍分布著圓形或長(zhǎng)條形的表皮細(xì)胞.圖1-b是同一位置的振幅圖，振幅圖比高度圖更形象地反映出物體的形態(tài)特征.

圖1 芥藍(lán)葉片表皮的AFM圖像Fig.1 The AFM image of epidermis of cabbage mustard， scanning area

對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的局部掃描可以得到氣孔的放大圖(圖2-a、圖2-c)，通過(guò)放大，得到氣孔的形貌特征，可以清楚地分辨氣孔由左右兩個(gè)半月形的保衛(wèi)細(xì)胞組成，環(huán)繞著保衛(wèi)細(xì)胞的是兩個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞，這種氣孔構(gòu)成方式為平軸式.圖2-b是三維圖，三維圖可以從各個(gè)角度觀察物體，可以得到更形象的結(jié)果.圖2-d是圖2-a中黑色剖面線所示的氣孔高度曲線圖，從曲線圖中可以得到氣孔張開(kāi)處的最大距離為2.1 μm，保衛(wèi)細(xì)胞的高度約為1 μm.

圖2 張開(kāi)的氣孔AFM圖像Fig.2 AFM image of an open stoma

隨著觀察時(shí)間的推移，張開(kāi)的氣孔蒸騰作用強(qiáng)烈，葉片所含水分不斷降低，保衛(wèi)細(xì)胞也開(kāi)始失去水分，氣孔開(kāi)始閉合.圖3-a所示為氣孔開(kāi)始閉合時(shí)候的圖像，從圖3-c中可以得到氣孔的張開(kāi)徑度變?yōu)榱?.9 μm，但保衛(wèi)細(xì)胞的高度并沒(méi)有變化，由于保衛(wèi)細(xì)胞失去了部分水分，保衛(wèi)細(xì)胞表面略微有皺縮出現(xiàn).所以氣孔的張開(kāi)、閉合是靠保衛(wèi)細(xì)胞改變自身的彎曲程度造成的.

圖3-b是圖3-a的三維重建圖，利用在三維軟件里的燈光設(shè)置，更清晰地看到圖3-a里不甚明顯的覆蓋在副衛(wèi)細(xì)胞上的微纖維結(jié)構(gòu)，這些纖維的直徑約為400 nm，間隔為200 nm左右.

圖3 閉合的氣孔AFM圖像Fig.3 AFM image of a close stoma

通過(guò)AFM直接進(jìn)行活體葉片氣孔的觀察，不但較好地保持了細(xì)胞原來(lái)的形態(tài)，而且還可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，并獲取氣孔的微觀結(jié)構(gòu)圖像，包括保衛(wèi)細(xì)胞、副衛(wèi)細(xì)胞以及用普通方法很難觀察到的覆蓋在副衛(wèi)細(xì)胞上的微纖維結(jié)構(gòu)等.AFM不僅可以研究細(xì)胞的二維或三維形貌和表面微觀結(jié)構(gòu)，甚至還可以研究細(xì)胞的彈性、粘度和力學(xué)性質(zhì)等.不僅可以研究細(xì)胞的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，還可以研究細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程.所有這些均有待于AFM技術(shù)的發(fā)展、成熟和普及，以及在生物研究上的應(yīng)用進(jìn)展.

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