Ctr1mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性的相關(guān)性

付世新 ，夏成 ，李鵬 ，沈冰蕾，王長遠(yuǎn)

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

銅是動(dòng)物和人不可缺少的微量元素之一，體內(nèi)含量過多或者缺乏都可引起機(jī)體代謝發(fā)生紊亂而發(fā)生疾病。養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，在畜禽日糧中添加或靜脈注射適量的銅可促生長，可提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[1]。但有關(guān)銅促生長的作用機(jī)理仍然不清，尤其是有關(guān)銅代謝轉(zhuǎn)運(yùn)過程的研究也比較少見，銅特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr是銅離子攝入蛋白，Ctr1蛋白在Ctr1-5等5種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中轉(zhuǎn)運(yùn)銅的能力最強(qiáng)，它是銅進(jìn)入細(xì)胞的主要傳送蛋白[2，3]，其表達(dá)量的多少直接關(guān)系到機(jī)體銅代謝的平衡，是研究銅如何進(jìn)行代謝和促生長作用的關(guān)鍵所在[4]。通過在PK15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的銅，來分析Ctr1基因mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)主要含銅酶超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性變化的相關(guān)性，探討銅代謝機(jī)理，為以后防治人和動(dòng)物疾病及動(dòng)物飼料添加劑的研制提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

豬傳代腎細(xì)胞PK15（本實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2 試劑

國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純CuSO4，胰蛋白酶、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于hyclone公司、無血清液體營養(yǎng)基購于Gibco公司，含銅 0.002 mg·L-1、L-谷氨酰氨和犢牛血清購于北京鼎國生物技術(shù)公司、Olig dT、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ，反轉(zhuǎn)錄酶AMV、Olig dT、焦磷酸二乙酯（DEPC）、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T載體購于TaKaRa公司;總RNA提取試劑盒購于QIAGEN公司;RT-PCR試劑盒,購自Promega公司;DNA回收試劑盒購于杭州維特杰生物技術(shù)公司;超氧化物歧化酶檢測試劑盒購于南京建成生物工程公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)Genbank中登錄的Ctr1基因mRNA序列,設(shè)計(jì)Ctr1和β-actin的引物。Ctr1基因目的片段大小為530 bp，β-actin大小目的片段大小為321 bp。兩對(duì)引物分別如下：

2 方法

2.1 Ctr1基因的克隆[5]

2.1.1 cDNA合成及PCR反應(yīng)

提取PK15細(xì)胞的總RNA，并以O(shè)lig dT為引物進(jìn)行RT-PCR，獲得cDNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min，94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10min。

雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。

各組總RNA的提取同上，取等量的mRNA用Olig dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA備用。取1 μL各組cDNA為模板，采用β-actin作為內(nèi)參，對(duì)Ctr1基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，重復(fù)5次,拍照后經(jīng)軟件分析計(jì)算密度比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

依據(jù)直線擬方程擬合得到的品位—噸位模式為：y＝-1015.6X+7666.5，擬合值與原始值相關(guān)系數(shù)R2=0.8369（圖7）

2.2 不同銅濃度對(duì)Ctr1基因mRNA表達(dá)量的影響

依那西普聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎合并間質(zhì)性肺炎患者相關(guān)指標(biāo)的影響 ………………………… 陳良敏等（2）：236

超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法（采用南京建成生物工程公司試劑盒）。

2.2.2 Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的檢測[6]

藍(lán)寶石也稱“剛玉”，英文叫做“Sapphire”，它的由來有各種說法。有的說源自于梵語“Sauriratna”（魔玉的寶石），有的說是源自阿拉伯海上一個(gè)島嶼的名字——Sapphirine。

2.2.1 分組

用1%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物并回收，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化連到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑法篩選出陽性菌落,用DNA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。HindⅢ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒。電泳觀察酶切結(jié)果,鑒定為陽性菌株送上海生工測序。

本項(xiàng)是一個(gè)兜底條款。除了上述規(guī)定的權(quán)利外，評(píng)估專業(yè)人員在評(píng)估活動(dòng)中還享有相關(guān)法律、行政法規(guī)規(guī)定的其他權(quán)利。值得注意的是，按照權(quán)利法定的原則，評(píng)估專業(yè)人員的權(quán)利只能由法律、行政法規(guī)授予，地方性法規(guī)、規(guī)章無權(quán)授予。法律是指全國人民代表大會(huì)及其常務(wù)委員會(huì)制定的法律規(guī)范的總稱。行政法規(guī)是指國務(wù)院根據(jù)憲法和法律，按照法定程序制定的有關(guān)行使行政權(quán)力，履行行政職責(zé)的規(guī)范性文件的總稱。

2.3 細(xì)胞內(nèi)銅離子含量測定

2.3.1 細(xì)胞分組和收集

m,andm,respectively.Set the viscous friction factor as l=50.The parameters for PD control are kp=1 and kd=1.8.

目的片段擴(kuò)增結(jié)果見圖1。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果分別為530 bp和320 bp左右的片段,與設(shè)計(jì)的片段大小相符。

2.3.2 樣品檢測

取處于對(duì)數(shù)生長期的PK15細(xì)胞,接種于6孔培養(yǎng)板上，37℃、5%CO2培養(yǎng)，10 h后更換尤無血清液體培養(yǎng)基2.85mL和150 μL 5種濃度的硫酸銅組成的 混 合 液 。 銅 濃 度 分 別 為 0、7.8、15.6、31.2、62.5 μmoL·L-1（根據(jù)生產(chǎn)實(shí)踐數(shù)據(jù)確定的實(shí)驗(yàn)梯度），編號(hào)為實(shí)驗(yàn)Ⅰ組到實(shí)驗(yàn)Ⅴ組。9 h后，收取各組細(xì)胞提取總RNA提取，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.組織載體 通過從教工黨員中選拔骨干教師擔(dān)任教研室主任，將教工黨支部服務(wù)關(guān)口前移，增加黨務(wù)與業(yè)務(wù)的有效距離，為全面實(shí)施特色教工黨支部建設(shè)提供了重要的組織載體。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果和分析

3.1 Ctr1基因及β-actinRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

細(xì)胞分組同上，于添加銅后10 h細(xì)胞收集和計(jì)數(shù)。用胰酶消化5～7min，細(xì)胞計(jì)數(shù)取相同細(xì)胞數(shù)后離心，再用PBS將每個(gè)樣品沖洗3次，洗去細(xì)胞表面吸附的銅離子。溶于420 μL蒸餾水中，超聲波破碎，待檢。

3.2 Ctr1基因的酶切鑒定結(jié)果

2.1.2 Ctr1基因的克隆

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切PMD-Ctr1質(zhì)粒，凝膠電泳顯示一條530 bp左右的片段，大小與Ctr1基因相符。經(jīng)比對(duì)同源性達(dá)到98%。

3.3 銅對(duì)Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR檢測Ctr1基因mRNA表達(dá)水平的變化表1。

圖1 Ctr1基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of RT-PCR product of Ctr1 gene

圖2 PMD-Ctr1質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Result of PMD-Ctr1 by double enzyme restriction analysis

表1 不同添加銅濃度Ctr1基因mRNA表達(dá)量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

表1 不同添加銅濃度Ctr1基因mRNA表達(dá)量(±SD)Table 1 Expreesion of Ctr1 gene mRNA effected by copper concentration(±SD)

注：同一列標(biāo)有不同字母表示差異顯著（p<0.05）

銅濃度/μmoL·L-1 07.815.631.262.5 Ctr1表達(dá)密度值/ng 14.55±0.153a 11.15±0.224ab 7.88±0.172bc 9.93±0.382c 4.76±0.26a β-actin表達(dá)密度值/ng 39.64±1.2439.07±2.0240.02±1.5638.98±1.6139.48±2.14 Ctr1/β-actin 值0.367±0.12a 0.285±0.11ab 0.196±0.11bc 0.255±0.24c 0.121±0.12a

從以上結(jié)果可以看出，β-actin的表達(dá)差異較小，保持均衡不變，加入不同濃度銅后，Ctr1基因mRNA的表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組間存在顯著差異，對(duì)照組表達(dá)量居首，其他組表達(dá)量依次為實(shí)驗(yàn)Ⅱ組、Ⅴ組、Ⅲ組、Ⅳ組，實(shí)驗(yàn)Ⅲ組明顯低于實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組（P<0.05），而與Ⅳ組間差異不顯著。

3.4 培養(yǎng)液中添加銅對(duì)細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性的影響

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性見表2。

表2 添加不同銅濃度對(duì)CuZn-SOD活性的影響(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

表2 添加不同銅濃度對(duì)CuZn-SOD活性的影響(±SD)Table 2 Effection of CuZn-SOD activity in cell by copper concentration in media(±SD)

注：同一列標(biāo)有相同字母表示差異不顯著（p>0.05）同一列標(biāo)有不同字母表示差異顯著（p<0.05）

細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性見表2。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。其中以添加31.2 μmoL·L-1Cu實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性最強(qiáng)，添加15.6 μmoL·L-1Cu組次之。加入銅后10 h各實(shí)驗(yàn)組CuZn-SOD活性高于對(duì)照組。加入銅后16 h，31.2 μmoL·L-1Cu 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi) CuZn-SOD 活性顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。加入銅后20 h，15.6 μmoL·L-1Cu 組和 31.2 μmoL·L-1Cu 組顯著高于其它組（P<0.05）。加入銅后24 h，各實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，細(xì)胞表面Ctr1基因mRNA的表達(dá)量與細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性呈反向性。

4 討論

Ctr1是位于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上高結(jié)合力的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Ctr1在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著非常重要的作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞銅代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，該蛋白含量或者Ctr1mRNA的表達(dá)量直接關(guān)系到細(xì)胞銅代謝的穩(wěn)定，從而影響機(jī)體代謝機(jī)能。研究表明酵母處于低銅狀況時(shí)，由于負(fù)反饋?zhàn)饔弥潦笴tr1蛋白的含量升高，而濃度處于0.1～1 μmoL·L-1范圍時(shí)，換言之處于非中毒銅狀態(tài)，該蛋白表達(dá)量隨銅濃度變化升降不明顯，但銅離子濃度超過10 μmoL·L-1時(shí)，Ctr1蛋白表達(dá)量則呈現(xiàn)減少趨勢，轉(zhuǎn)運(yùn)銅的能力降低，細(xì)胞則采取吞飲的方式將銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)[7]。這說明，銅水平課調(diào)控Ctr1蛋白表達(dá)量，缺乏時(shí)可促進(jìn)該蛋白的表達(dá)，過量則出現(xiàn)Ctr1表達(dá)抑制。具體是在mRNA表達(dá)過程中還是在翻譯過程中增多或減少了Ctr1蛋白的表達(dá)量，迄今還沒有一個(gè)明確的說法，可能同時(shí)是存在某些調(diào)控Ctr1蛋白基因的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)。同時(shí)，在細(xì)胞膜上Ctr1蛋白是如何將銅轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)作機(jī)制還尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

一是進(jìn)一步加強(qiáng)市場和疫情預(yù)警信息，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶加強(qiáng)生產(chǎn)管理，防控疫??；二是加強(qiáng)市場監(jiān)管，打擊屠宰企業(yè)壓價(jià)行為，減少養(yǎng)殖戶損失；三是推廣疫病保險(xiǎn)，減少養(yǎng)殖戶的損失，如安華保險(xiǎn)推出非洲豬瘟保險(xiǎn)（育肥豬和母豬分別支付保費(fèi)5元和10元/頭，賠付500元和1000元）；四是強(qiáng)化疫區(qū)尤其是主產(chǎn)區(qū)屠宰能力，減緩疫情發(fā)生時(shí)出欄壓力；五是完善調(diào)運(yùn)監(jiān)管方案，通過大區(qū)域劃分等形式實(shí)現(xiàn)種豬和仔豬的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)調(diào)運(yùn)，保障生豬生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

針對(duì)以上問題對(duì)Ctr1基因mRNA表達(dá)對(duì)不同銅濃度的反應(yīng)進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Ctr1基因mRNA表達(dá)受銅離子濃度的調(diào)控，在0～62.5 μmoL·L-1Cu濃度范圍內(nèi)時(shí)，呈雙相表達(dá)反應(yīng)。與細(xì)胞內(nèi)CuZn-SOD活性檢測結(jié)果比較，兩者呈明顯的反相關(guān)系，由此可以推斷，銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 mRNA表達(dá)水平的減少，可導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成也隨之減少，從而引起細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子的數(shù)量減少，減少了細(xì)胞中毒的可能,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)性作用。實(shí)驗(yàn)Ⅴ組的結(jié)果表明，當(dāng)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 mRNA表達(dá)量回升時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CuZn-SOD活性卻反而降低了。這些與劉國文等[8]報(bào)道的結(jié)果一致，當(dāng)培養(yǎng)液中銅濃度添加到62.5 μmoL·L-1時(shí)，軟骨細(xì)胞細(xì)胞骨微絲、微管、強(qiáng)力纖維均發(fā)生不同程度的損傷變形。這個(gè)添加濃度導(dǎo)致Ctr1 mRNA表達(dá)水平提高是否與骨架結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，還需進(jìn)一步探討。

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