木霉菌T38D對大豆根腐病菌的拮抗機(jī)制

趙永強(qiáng)，臺(tái)蓮梅，郭永霞，張亞玲，靳學(xué)慧

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

大豆根腐病是一種分布廣、危害重、病原菌種類多和防治困難的世界性病害，在我國以黑龍江省東北部地區(qū)發(fā)生較重。該病主要危害大豆根系，影響作物對水分和養(yǎng)分的吸收，從而造成大量的減產(chǎn)[1，2]。目前防治大豆根腐病主要依靠化學(xué)藥劑，不僅會(huì)嚴(yán)重破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，并對環(huán)境造成污染，而生物防治制劑可以克服上述問題，有利于現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。木霉（Trichoderma spp.）是一種很好的生防微生物，它通過空間競爭、重寄生和抗生作用等一系列拮抗作用能有效抑制許多病原菌的活動(dòng)，對多種真菌性土傳病害有明顯的生防效果，但針對于大豆根腐病菌拮抗機(jī)制的報(bào)道較少，而且木霉菌的不同菌株對同種病原菌的抑制效果也有所不同，為此，就木霉菌T38D對大豆根腐病菌的拮抗機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

木霉菌（Trichoderma spp.）T38D；立枯絲核菌（Rhizoctonia solan）、 尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、燕麥鐮孢菌（Fusarium avenaceum）、茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和終極腐霉菌（Pythium ultimum）。

1.2 木霉菌T38D與大豆根腐病菌的對峙培養(yǎng)

對峙培養(yǎng)：將培養(yǎng)2 d，直徑為5 mm的木霉菌餅和大豆根腐病菌菌餅接種在直徑為90 mm的PDA平板培養(yǎng)基上，使2個(gè)菌餅直線距離為60 mm，每個(gè)處理3次重復(fù)，以只接大豆根腐病菌作對照，在25℃下對峙培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察、記錄菌落生長情況。并采用拮抗指數(shù)評價(jià)競爭作用強(qiáng)度。

拮抗指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為[3]：

Ⅰ級，木霉菌絲占據(jù)平皿100%；

Ⅱ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＞2/3；

Ⅲ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＞1/3，＜2/3；

Ⅳ級，木霉菌絲占據(jù)平皿＜1/3；

Ⅴ級，病原菌占據(jù)平皿100%。

1.3 木霉菌T38D對大豆根腐病菌重寄生現(xiàn)象觀察

取熔化的無菌PDA培養(yǎng)基用滅菌的毛刷蘸取后，刷在已滅菌載玻片上，制成1mm厚的PDA膜，再分別接種大小為2 mm×2 mm木霉菌和病原菌的菌絲塊于載玻片兩端，二者相距2 cm，25℃培養(yǎng)24～72 h，用OLYMPUS BX-51型系統(tǒng)顯微鏡觀察、照相。

1.4 木霉菌T38D的難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的拮抗作用

采用圓盤濾膜法[4]：鋪賽璐玢膜于PDA平板上，在其中央接種木霉菌T38D的菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)。待木霉菌T38D的菌絲長滿賽璐玢膜前，將賽璐玢膜移去。在平板中央接種大豆根腐病菌菌餅，25℃下恒溫培養(yǎng)。同時(shí)以不鋪賽璐玢膜的PDA平板上接種大豆根腐病菌菌餅作對照。處理重復(fù)3次。接種后每隔24 h測定菌落直徑，計(jì)算其菌絲生長抑制率。

1.5 木霉菌T38D的易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的拮抗作用

采用對扣培養(yǎng)法測定[5]：在PDA平板上接種木霉菌T38D的菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)2 d后，在其上方蒙上無菌的圓形賽璐玢膜（賽璐玢膜直徑比培養(yǎng)皿直徑大10 mm），再將剛接種過直徑為5 mm大豆根腐病菌菌餅的PDA平板倒扣其上，封口膜密封后，25℃恒溫培養(yǎng)。以空白PDA平板與接種大豆根腐病菌的PDA平板對扣培養(yǎng)作對照。處理重復(fù)3次。接種后每隔24 h測量大豆根腐病菌菌落直徑，計(jì)算其菌絲生長抑制率。計(jì)算方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌T38D與大豆根腐病菌的對峙培養(yǎng)

在木霉菌T38D與立枯絲核菌對峙培養(yǎng)中，立枯絲核菌的菌絲生長速度比木霉菌T38D生長快，48 h兩菌落接觸，立枯絲核菌約占平板的2/3，木霉菌約占1/3，接觸后，立枯絲核菌很快停止生長，木霉菌T38D則繼續(xù)生長；從平板正面觀察，可見木霉菌T38D的菌絲將立枯絲核菌的菌絲逐漸覆蓋，7 d可將立枯絲核菌菌落全部覆蓋。與對照中的立枯絲核菌相比，對峙培養(yǎng)中的立枯絲核菌無氣生菌絲且菌絲大量消解，極少產(chǎn)生菌核或不產(chǎn)生菌核。

在木霉菌T38D與尖孢鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、茄腐鐮孢菌、禾谷鐮孢菌和終極腐霉菌對峙培養(yǎng)中，木霉菌的菌絲生長速度比病原菌菌絲生長快，72 h時(shí)平板內(nèi)兩菌落均可接觸，木霉菌菌落約占平板的2/3，病原菌約占1/3，接觸后，病原菌很快停止生長，木霉菌T38D則繼續(xù)生長，7 d可將終極腐霉菌菌落全部覆蓋，木霉菌雖不能將尖孢鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的菌落完全覆蓋，但可在病原菌菌落內(nèi)看到大量的木霉菌綠色孢子。

表1 木霉菌T38D對6種病原菌的拮抗指數(shù)Table1 Inhabiting of Trichoderma against pathogens of soybean root rot

2.2 木霉菌T38D對大豆根腐病菌重寄生作用

顯微觀察表明，木霉菌T38D對尖孢鐮孢菌、立枯絲核菌、燕麥鐮孢菌和終極腐霉菌都有重寄生作用（圖1～4），對禾谷鐮孢菌和茄腐鐮孢菌未觀察到重寄生現(xiàn)象。

木霉菌的菌絲在與病原菌菌絲接觸后（36 h），會(huì)產(chǎn)生出大量的細(xì)小分支，這些分支有些緊貼病原菌菌絲與病原菌菌絲平行生長，有些則纏繞于病原菌菌絲上，在木霉菌與病原菌菌絲交界處，可以看到大量的病原菌的菌絲被木霉菌的菌絲緊密纏繞的現(xiàn)象（圖1～3）；48 h后可以觀察到被木霉菌纏繞的尖孢鐮孢菌菌絲有分解的現(xiàn)象，立枯絲核菌菌絲有斷裂的現(xiàn)象（圖5，圖 6）。

2.3 木霉菌T38D的難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的拮抗作用

待對照將要長滿皿時(shí)，測量病原菌的菌落直徑，從測量結(jié)果中可以看出，木霉菌T38D生長過程中產(chǎn)生的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌產(chǎn)生不同的抑制作用（見表2）。木霉菌T38D對立枯絲核菌和終極腐霉菌的抑制作用強(qiáng)，抑制率分別為100%和87.6%；對鐮孢菌的抑制作用較弱，其中對燕麥鐮孢菌的抑制率為75.2%，對其他鐮孢菌的抑制率為40%～50%。

表2 木霉菌T38D難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的抑制作用Table 2 Inhibition rates of Trichoderma production of non-volatile antibiotics to pathogens of soybean root rot

2.4 木霉菌T38D易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的拮抗作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，木霉菌T38D生長過程中產(chǎn)生的易揮發(fā)性代謝物質(zhì)對立枯絲核菌和終極腐霉菌有一定的抑制作用，抑制率分別為35.1%和47.3%；對鐮孢菌的抑制作用不明顯（表3）。

表3 木霉菌T38D易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大豆根腐病菌的抑制作用Table 3 Inhibition rates of Trichoderma production of volatile antibiotics to pathogens of soybean root rot

3 結(jié)論與討論

從對峙培養(yǎng)的結(jié)果可以看出，木霉菌T38D生長速度比鐮孢菌生長速度快，能在平板中迅速占領(lǐng)生長空間，當(dāng)木霉菌菌落與鐮孢菌菌落接觸后，鐮孢菌的生長會(huì)很快受到抑制，而木霉菌T38D則繼續(xù)生長并產(chǎn)生大量的分生孢子，逐漸將鐮孢菌覆蓋。立枯絲核菌和終極腐霉菌的生長速度雖然比木霉菌T38D生長的快，但是其菌落會(huì)很快被木霉菌菌絲覆蓋，其菌絲會(huì)很快消解。結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果，可以看到木霉菌T38D的菌絲能夠以纏繞等方式重寄生在尖孢鐮孢菌、立枯絲核菌、燕麥鐮孢菌、終極腐霉菌的菌絲上。通過圓盤濾膜法和對扣培養(yǎng)法可以看出，木霉菌T38D的代謝產(chǎn)物也是重要的抑菌物質(zhì)，其中難揮發(fā)性的代謝物質(zhì)對引起大豆根腐病的這幾種病原菌都有較高的抑制率，揮發(fā)性的代謝物對立枯絲核菌和腐霉菌有一定的抑制作用，但對幾種鐮孢菌的抑制效果不明顯；可見木霉菌的代謝產(chǎn)物中，難揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物是主要的抑菌物質(zhì)。

木霉菌對大豆根腐病菌拮抗機(jī)制的研究報(bào)道較少，孫冬梅和王偉分別報(bào)導(dǎo)了黃綠木霉和綠色木霉對鐮孢菌的抑制作用[6，7]，試驗(yàn)中的木霉菌T38D對鐮孢菌重寄生作用，空間競爭能力，與孫冬梅報(bào)道的黃綠木霉對鐮孢菌拮抗有相似的結(jié)果。試驗(yàn)還就木霉菌T38D對引起大豆根腐病的立枯絲核菌和終極腐霉菌的拮抗作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)T38D對這兩種根腐病菌的抑制效果比對鐮孢菌的抑制效果更明顯。

木霉菌對大豆根腐病菌的抑制是競爭、重寄生和抗生作用等幾種拮抗機(jī)制的綜合作用的結(jié)果，試驗(yàn)除了研究木霉菌對大豆根腐病菌的競爭作用和重寄生作用，還發(fā)現(xiàn)木霉菌的代謝產(chǎn)物對根腐病菌的抑制作用也很明顯，但是代謝產(chǎn)物起抑菌作用的具體物質(zhì)還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］李長松，趙玖華，楊崇涼，等.我國大豆根腐病研究概況及存在的問題［J］.中國油料作物，1997，19(3)：82-84.

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［5］Whipps J M,Magan N.Effects of nutrient status and water potential of media on fumgal grouth and antagonistpathogen interactions［J］.Bulletin OEPP/EPPO Bulletin，1987,17:581-591.

［6］孫冬梅，楊謙，宋金柱.黃綠木霉菌對大豆根腐病鐮孢菌的拮抗作用［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2005，27(3)：58-61.

［8］王偉，趙謙，楊微.木霉對土傳病原尖孢鐮孢菌的拮抗作用［J］.中國生物防治，1997，(1)：45-47.