PPARs激動劑羅格列酮對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬神經(jīng)元的保護作用

牛海雁,鄭輯英,李光來,薛國芳,霍 瑩

癲癇是以神經(jīng)元異常反復過度同步放電為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)臨床綜合征。研究表明,細胞凋亡是SE后腦神經(jīng)元死亡的形式之一,在SE后腦神經(jīng)元死亡過程中扮演重要角色,可導致星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生,也是異常興奮性突觸環(huán)路形成的重要原因。RSG可能有抗SE后神經(jīng)元凋亡作用,對癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷具有潛在的治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只,體重180 g～250g(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供);氯化鋰(中國醫(yī)藥集團上海試劑公司);匹羅卡品(美國Sigma公司);Bcl-2、Bax多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒(武漢博士德公司);DAB試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);羅格列酮(英國葛蘭素史克公司)。

1.2 動物分組及模型的建立 選用健康成年雄性Wistar大鼠54只,隨機分為模型組(M 組)、羅格列酮組(RSG組)各 24只(每組按時間點再分為4個亞組,每組6只)以及對照組(N組)(6只)。各組均選用灌胃法給予處理。N組與M組給予等容積生理鹽水;RSG組按4 mg/(kg?d)給予RSG溶液。灌胃5 d后,除對照組外,其余各組均腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,18 h后再腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30 mg/kg,N組給予生理鹽水腹腔注射。在RSG組存活大鼠于SE后每24 h給予RSG 4 mg/kg灌胃,而M組及N組給予等容積生理鹽水。

1.3 癇性發(fā)作行為觀察 參照Racine的評價標準。0級:無任何發(fā)作跡象;Ⅰ級:凝視,頭面部輕微顫動;Ⅱ級:點頭或濕狗樣抖動;Ⅲ級:前肢局限性驚厥;Ⅳ級:具有后肢站立的全身強直性驚厥;Ⅴ級:具有站立伴摔倒的全身強直-陣攣性發(fā)作。癇性發(fā)作持續(xù)超過 30 min為SE。在SE達1 h時,予腹腔注射地西泮10 mg/kg,終止癇性發(fā)作。

1.4 標本處理 M組和 RSG組大鼠分別于SE后 12 h、24 h、48 h、7 d處死,N組同SE后12 h組處死。大鼠用5%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后剪開胸腔,將注射針頭插入左心室,剪開右心耳,快速灌注生理鹽水,待右心耳處流出澄清液體,立即向心臟內(nèi)灌注4%多聚甲醛50 mL,灌注速度10 mL/min。注射完畢后立即斷頭取腦,置入4%的多聚甲醛后固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,在海馬區(qū)連續(xù)切片,片厚5 μ m。

1.4.1 TUNEL染色 嚴格按試劑盒說明書步驟進行操作,以不加TdT酶作為陰性對照,細胞核染成棕褐色的為凋亡陽性細胞。在400倍顯微鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù),每張片隨機選擇5個視野。

1.4.2 Bcl-2、Bax表達的檢測 按常規(guī)SABC法行免疫組化檢測,工作濃度均為1∶150,DAB顯色,蘇木精輕度復染。每張切片取 5個(×400倍)視野,測定每個視野的陽性細胞數(shù),取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 行為學觀察 N組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。M組大鼠在給予匹羅卡品后15 min～30 min均出現(xiàn)洗臉樣動作、節(jié)律性咀嚼、點頭等面部痙攣樣動作;隨后出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣,之后很快表現(xiàn)為前肢陣攣伴站立,進一步發(fā)展到全身強直陣攣發(fā)作伴站立、摔倒,反復發(fā)作,均達到Ⅳ級～ Ⅴ級發(fā)作,達到癲癇持續(xù)狀態(tài)。在造模成功后有3只死亡,隨機選出同樣體重范圍的大鼠替代。RSG組大鼠也均達到SE,但癇性發(fā)作程度較M組輕,多在Ⅲ級～ Ⅳ級發(fā)作,自用藥至發(fā)作的潛伏期也長,無一例死亡大鼠。

2.2 TUNEL檢測結(jié)果 N組大鼠海馬未見TUNEL陽性細胞。M組SE后12 h可見TUNEL陽性細胞,48 h達高峰,7 d時下降。RSG組與M組凋亡陽性細胞數(shù)的動態(tài)變化趨勢類似,但SE后各個時間點RSG組的陽性細胞數(shù)均顯著少于M組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 M組與RSG組大鼠SE后海馬T UNEL陽性細胞數(shù)(±s)

表1 M組與RSG組大鼠SE后海馬T UNEL陽性細胞數(shù)(±s)

組別 12 h 24 h 48 h 7 d M 組 18.54±3.55 32.09±5.14 61.98±4.99 43.42±4.41 RSG 組 9.40±2.941) 18.81±4.191)33.92±5.311) 21.26±4.211)與M同時間點比較,1)P＜0.05

2.3 Bcl-2、Bax免疫組化及Bcl-2/Bax比率結(jié)果 Bcl-2在N組有基礎(chǔ)量表達。SE后12 h,M組大鼠海馬有較多Bcl-2的表達,24 h開始減弱,48 h后僅有少量表達。RSG組SE后12h、24 h、48 h、7 d與M組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表2。Bax在N組有基礎(chǔ)量表達。SE后12 h,M組大鼠海馬有Bax表達,24 h達高峰,48 h后表達量下降。M組大鼠SE后12h Bax表達高于N組,RSG組SE后各時間點與M組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表3。M組大鼠SE后12h Bcl-2/Bax比值高于N組,RSG組SE后各時間點與M組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表4。

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)比較(±s)

組別 12 h 24 h 48 h 7 d N 組 9.67±1.52 M 組 34.59±3.931) 30.40±2.861) 22.55±3.581) 10.53±3.61 RSG 組 38.78±3.931)2) 48.70±4.191)2) 34.23±3.461)2) 18.45±2.781)2)與N比較,1)P＜0.05;與M 組同時間點比較,2)P＜0.05

表3 各組大鼠海馬Bax免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)比較(±s)

表3 各組大鼠海馬Bax免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)比較(±s)

組別 12 h 24 h 48 h 7 d N 組 11.30±1.39 M 組 32.24±4.341)2) 43.60±5.121)2) 36.45±3.841)2) 22.31±3.421)2)RSG 組 24.50±4.081)2) 32.23±4.261)2) 26.38±3.601)2) 16.14±2.831)2)與N組比較,1)P＜0.05;與M組同時間點比較,2)P＜0.05

表4 各組大鼠海馬Bcl-2/Bax比率比較(±s)

表4 各組大鼠海馬Bcl-2/Bax比率比較(±s)

組別 12 h 24 h 48 h 7 d N 組 0.86±0.11 M 組 1.08±0.091) 0.70±0.051) 0.62±0.041) 0.46±0.121)RSG 組 1.60±0.111)2) 1.52±0.071)2) 1.30±0.051)2) 1.15±0.041)2)與N組比較,1)P＜0.05;與M組同時間點比較,2)P＜0.05

3 討 論

細胞凋亡是SE后腦神經(jīng)元死亡的形式之一,也是異常興奮性突觸環(huán)路形成的重要原因。本實驗觀察了氯化鋰-匹羅卡品致大鼠SE后12 h至7 d海馬神經(jīng)元凋亡的動態(tài)變化以及RSG對SE后神經(jīng)元凋亡的影響。TUNEL染色結(jié)果顯示,對照組海馬無T UNEL陽性細胞。模型組SE后海馬區(qū)可見凋亡神經(jīng)細胞,48 h達高峰,7 d時下降。表明SE后海馬區(qū)存在神經(jīng)元凋亡,RSG組各時間點海馬凋亡神經(jīng)細胞數(shù)與模型組比較均明顯減少(P＜0.05),表明RSG可抑制癲癇發(fā)作后的海馬神經(jīng)元凋亡。

Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要基因,包括抑制細胞凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、LMW5-HL和 BHRF-1,促進細胞凋亡的Bcl-Xs、bax、bad和bak等。近年的研究表明癲癇發(fā)作后Bcl-2表達異常,提示Bcl-2與癲癇后神經(jīng)元損傷關(guān)系密切。Bc1-2蛋白位于線粒體膜或核膜及溶酶體膜的膜蛋白,可以通過多種途徑有效地抑制細胞凋亡的發(fā)生;Bax蛋白在組織中廣泛表達,可以促進細胞凋亡的發(fā)生;Bax與Bcl-2構(gòu)成異二聚體,而Bax自身組成同二聚體。當Bcl-2與Bax的結(jié)合點斷裂,則Bcl-2對細胞的保護性消失,Bc1-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/Bax)的比值,兩者比值(Bcl-2/Bax)增大時促進細胞存活,反之則導致細胞死亡[1]。本實驗顯示,對照組海馬中Bcl-2與bax陽性細胞均低,提示可能在生理條件下Bcl-2與bax未被激活參與細胞凋亡活動;而模型組Bcl-2和bax表達顯著增多,表明SE同時誘導Bcl-2和Bax表達,RSG組SE后各時間點Bcl-2的表達均高于模型組,RSG組SE后各時間點Bax的表達均低于模型組,RSG組SE后各時間點Bcl-2/Bax的比值均高于模型組,表明RSG可能通過增加Bc1-2表達,降低Bax表達,從而對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用,減輕SE后神經(jīng)元損傷。

一些實驗表明RSG可能通過多種途徑、多種機制發(fā)揮抗炎、抗自由基,具有神經(jīng)保護作用。RSG已經(jīng)成功應(yīng)用于治療2型糖尿病而沒有顯著的細胞毒性和并發(fā)癥[2,3],并且不改變非糖尿病人類及嚙齒類血清葡萄糖水平[4-6],可直接用于臨床治療。是一有前景的應(yīng)用于癲癇的腦保護藥物,其多種機制還有待進一步研究。

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