細(xì)辛腦注射液對(duì)槐定堿致癇大鼠Caspase3及熱休克蛋白-70表達(dá)的影響1)

甄軍麗,王維平

在眾多癲癇模型中,點(diǎn)燃癲癇模型類(lèi)似臨床患病的癲癇發(fā)作,是人們最為感興趣的癲癇模型之一,其中戊四氮腹腔注射所致SD大鼠慢性點(diǎn)燃模型較為常見(jiàn),而對(duì)槐定堿致癇模型較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大劑量槐定堿致癇,觀察大鼠腦內(nèi)Caspase3及熱休克蛋白-70(hsp-70)含量的變化,探討細(xì)辛腦注射液對(duì)致癇大鼠抗癲癇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠42只,雄性,體重

180 g±20 g,SPF級(jí),由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào):DK0505-0158。

1.2 藥物、試劑與儀器 槐定堿(sophoridine,SR)由寧夏藥物研究所提供,批號(hào):991230;細(xì)辛腦注射液,購(gòu)于桂林南藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H45021202;卡馬西平由上海第六制藥廠提供;一抗購(gòu)于santa cruz biotechnology;二抗由中杉生物工程有限公司提供;冰凍切片機(jī)(德國(guó) LEICA RM-2135);研究用生物顯微鏡(日本OLYM PUS BX60);CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)M otic Med 6.0);染色劑甲苯胺藍(lán)(購(gòu)于上海生化試劑有限公司)。

1.3 方法 42只大鼠隨機(jī)均分為6組,每組7只,分別為空白組、模型組、卡馬西平對(duì)照組、細(xì)辛腦高劑量組、細(xì)辛腦中劑量組、細(xì)辛腦低劑量組。其中空白組、模型組予飼雙蒸水2 mL/d,卡馬西平對(duì)照組給予卡馬西平10 mg/(kg?d),細(xì)辛腦組高、中、低劑量組濃度按9 mg/kg、5 mg/kg、2 mg/kg配制,分別飼藥10 d。第11天除空白組外均予槐定堿11 mg/kg腹腔注射,對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察,于 24 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,開(kāi)胸暴露心臟,升主動(dòng)脈插管,以生理鹽水250 mL和4%多聚甲醛固定30 min后,迅速取出全腦,沿腦正中矢狀切開(kāi),取大腦于相同固定液中固定24 h(4℃),次日以30 μ m 厚度進(jìn)行冰凍切片,行連續(xù)冠狀切片,一半用于檢測(cè)皮質(zhì)和海馬的Caspase3及 hsp-70表達(dá)情況;另一半行 Nissle染色,中性樹(shù)膠封片,高倍鏡(X400倍)下觀察。

1.4 觀察項(xiàng)目 參考Racine癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察大鼠癲癇發(fā)作分級(jí)并記錄;行腦組織Nissle染色法,觀察皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元丟失或壞死情況;運(yùn)用CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像與分析系統(tǒng)記錄各組Caspase3及hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞密度。

1.5 大鼠驚厥發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 參考Racine癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),0級(jí):無(wú)反應(yīng);Ⅰ級(jí):節(jié)律性嘴和面部抽動(dòng)或洗臉;Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭或甩尾;Ⅲ級(jí):單肢抽動(dòng);Ⅳ級(jí):多肢抽動(dòng)和強(qiáng)直;Ⅴ級(jí):全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)結(jié)果,采用Ridit、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察(見(jiàn)表 1)

表1 各組大鼠腹腔注射槐定堿后癲癇發(fā)作情況 只

2.2 腦組織形態(tài)學(xué)變化 Nissle染色結(jié)果顯示,細(xì)辛腦中、高劑量組、空白組和卡馬西平對(duì)照組腦組織幾乎呈均勻一致的紫藍(lán)色,細(xì)胞密度大,神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,為三角形、長(zhǎng)條形或多邊形,胞漿染色清晰,尼氏體著藍(lán)色,胞核淡然,海馬 CA1區(qū)錐體細(xì)胞3層～4層,形態(tài)規(guī)則,未見(jiàn)明顯神經(jīng)元丟失;槐定堿模型組可見(jiàn)神經(jīng)元皺縮體積縮小,與周?chē)M織有脫離,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多數(shù)胞漿呈空泡狀,海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列散亂,無(wú)層次感,尼氏體減少,部分神經(jīng)元丟失,細(xì)胞密度小;細(xì)辛腦小劑量組可見(jiàn)較多神經(jīng)元腫脹,少量神經(jīng)元皺縮,胞核深淺不均,細(xì)胞密度較大,與模型組比較,神經(jīng)元損傷減輕、丟失減少,提示細(xì)辛腦治療組對(duì)癲癇后神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.3 Caspase3及hsp-70含量(見(jiàn)表 2)

表2 各組Caspase3及hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞(±s)/100 g

表2 各組Caspase3及hsp-70陽(yáng)性細(xì)胞(±s)/100 g

組別 n Casepase3 hsp-70空白組 7 5.94±2.13 1.39±1.22模型組 7 23.04±2.26 18.77±2.24卡馬西平對(duì)照組 7 15.83±2.891) 7.39±1.691)細(xì)辛腦低劑量組 7 13.46±3.011) 6.07±2.051)細(xì)辛腦中劑量組 7 9.86±2.781) 5.54±1.381)細(xì)辛腦高劑量組 7 7.98±2.761) 2.49±1.571)與模型組比較,1)P＜0.05

3 討 論

癲癇的病因病機(jī)十分復(fù)雜,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,本病多由先天稟賦受損,氣血瘀滯,或驚恐勞傷過(guò)度,肝、脾、腎三臟功能失調(diào),使痰壅風(fēng)動(dòng),上擾清竅而發(fā)病。發(fā)病初期多正盛邪實(shí),日久必?fù)p傷正氣,痰濁、瘀血等邪實(shí)沉痼,形成虛實(shí)夾雜。因“壯火食氣”亦可導(dǎo)致氣虛;肝風(fēng)痰濁日久亦可出現(xiàn)木旺克脾土,致脾虛水濕失運(yùn),痰濁內(nèi)生,脾虛痰盛日久,氣血生化乏源則可致心血不足,中焦氣機(jī)失運(yùn);又因“精血同源”,日久必累及肝腎之陰精而成肝腎陰虛證?？梢?jiàn)本病病變臟腑以心肝脾腎為主,病理特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜。治療大法當(dāng)以扶正祛邪,標(biāo)本兼顧。本品是中藥石菖蒲的主要有效成分,臨床上常用于成人和兒童細(xì)菌性肺炎、肺內(nèi)感染、急慢性支氣管炎、支氣管哮喘、阻塞性肺氣腫、肺心病、支氣管擴(kuò)張及支氣管肺癌以及感冒引起的咳嗽、咯痰、喘息。最新研究認(rèn)為本品對(duì)癲癇發(fā)作有顯著療效,其可能的機(jī)制是:α細(xì)辛腦能提高大腦皮層的點(diǎn)刺激閾,抑制電刺激的突觸傳導(dǎo)及癇性放電。以石菖蒲為君藥,祛痰濁風(fēng)邪,兼具開(kāi)竅啟閉、祛風(fēng)止痙之功效。

本實(shí)驗(yàn)選擇了大劑量槐定堿(11 mg/kg)制作大鼠癲癇模型,可使神經(jīng)元過(guò)度興奮,引起動(dòng)物Ⅲ級(jí)及以上癲癇發(fā)作,且發(fā)作頻繁,可持續(xù)0.5 h以上。這個(gè)模型類(lèi)似于癲癇部分性發(fā)作。張琳娜等[1]實(shí)驗(yàn)表明,槐定堿2.94 mg/kg可明顯抑制青霉素致癇大鼠皮層癲癇樣放電,使?jié)摲诿黠@延長(zhǎng),改善神經(jīng)元細(xì)胞損傷和清除氧自由基,具有一定的抗癲癇作用,而槐定堿5.88 mg/kg和11.76 mg/kg卻可加強(qiáng)癇樣發(fā)作。提示槐定堿可能具有雙向調(diào)節(jié)性,對(duì)于不同劑量槐定堿對(duì)中樞活動(dòng)的不同影響和作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

Caspase家族目前已發(fā)現(xiàn) 14個(gè)成員,其核心成員為Caspase3。該蛋白酶于1994年由Fernandes從人T細(xì)胞系首次克隆,因編碼相對(duì)分子質(zhì)量為32×103的半胱氨酸蛋白酶又稱(chēng)CPP32[2]。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)人類(lèi)Caspase3全長(zhǎng)氨基酸序列與介導(dǎo)線蟲(chóng)凋亡的Ced3蛋白的相似性最高,被認(rèn)為是Ced3在哺乳動(dòng)物中真正的對(duì)應(yīng)者。Caspase3所作用的底物多為維持細(xì)胞生命活動(dòng)的重要功能蛋白,分別參與DNA修復(fù)、mRNA裂解和細(xì)胞骨架重建。多種多樣的刺激因素啟動(dòng)的信號(hào)激活Caspase3,引起多效基因變化,使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活[3,4],從而導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性地走向凋亡,這為進(jìn)一步研究癲癇發(fā)作與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)工具和基礎(chǔ)。Gillardon采用原位雜交檢測(cè)了由海人藻酸誘發(fā)的癲癇大鼠的海馬組織,發(fā)現(xiàn)海馬組織存在Caspase3基因表達(dá)和凋亡神經(jīng)元,因而推測(cè)可能是神經(jīng)元癲癇樣放電的興奮性毒性導(dǎo)致Caspase3的激活表達(dá)和海馬神經(jīng)元的凋亡丟失[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),癲癇樣放電導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡丟失,Caspase3參與介導(dǎo)了該凋亡過(guò)程,由此設(shè)想,或許將來(lái)通過(guò)阻止Caspase3表達(dá)或抑制Caspase3活性這一策略可以挽救凋亡神經(jīng)元,延緩海馬硬化的進(jìn)程。

而hsp-70是機(jī)體在遭受各種刺激后,誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白。hsp-70是熱休克蛋白(稱(chēng)為“分子伴侶“或”伴侶蛋白”)中最保守和最主要的一類(lèi)[6],在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著,被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí),hsp-70表達(dá)后分別在胞漿和胞核中同變性蛋白結(jié)合,防止變性蛋白進(jìn)一步折疊,促使其恢復(fù)或加速其降解和消除,維持神經(jīng)元內(nèi)蛋白自穩(wěn),以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。目前,神經(jīng)元受損時(shí),hsp-70表達(dá)對(duì)受損神經(jīng)元的保護(hù)作用已基本肯定[7],因此,hsp-70在腦內(nèi)表達(dá)的速度及數(shù)量在一定程度上影響神經(jīng)元對(duì)癲癇興奮性損傷的耐受性,并可能是癲癇腦內(nèi)神經(jīng)元選擇性脫失的內(nèi)在機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)中細(xì)辛腦注射液對(duì)槐定堿致癇大鼠腦組織中caspase3及hsp-70的合成有明顯抑制作用,能夠顯著控制癲癇發(fā)作,減輕神經(jīng)元在癲癇發(fā)作時(shí)的興奮性損傷。該藥物對(duì)癇性發(fā)作后Caspase3及hsp-70的表達(dá)相協(xié)調(diào),這和鄭虹等[8]對(duì)兩者在腫瘤方面的研究報(bào)道有些不一致,可能與癲癇發(fā)作的持續(xù)時(shí)間和程度有關(guān)。究竟凋亡和應(yīng)激蛋白的表達(dá)之間是否具有相關(guān)性,具體作用機(jī)制和作用途徑尚有待進(jìn)一步去研究。

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