保護劑對冷干和貯存過程中乳桿菌存活率的影響

潘 艷 何勝江

隨著我國畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，飼料的需求量日益加大。青貯飼料由于其適口性好、消化率高，以及可以緩解青綠飼料的地區(qū)與季節(jié)的不平衡等原因，已成為家畜常用的粗飼料。在實際生產(chǎn)中，往往因有害微生物的大量生長使青貯飼料的營養(yǎng)損失嚴重。為了減少青貯飼料在青貯過程中的腐爛及營養(yǎng)成分損失，應促進乳酸菌的增殖，迅速降低青貯過程的pH值，抑制其它有害微生物的生長，以達到改善青貯飼料品質、提高動物生產(chǎn)性能的目的。使用青貯添加劑是改善青貯飼料發(fā)酵品質的重要手段。乳酸菌添加劑作為一種微生物青貯添加劑，具有其它青貯添加劑不可比擬的優(yōu)點，受到了人們極大的關注。

在國外，乳酸菌添加劑在20世紀60年代就已有研究，且取得了一定的成果。但我國起步比較晚，在畜牧業(yè)中的應用甚少。因此，乳酸菌添加劑的開發(fā)研究及應用前景廣泛。

19世紀初就提出的真空冷凍干燥原理，直到1890年才被首次運用于干燥生物器官和組織。在之后的數(shù)十年中，真空冷凍干燥技術的應用一般都只是在實驗室中，二次大戰(zhàn)后才得以應用于不同的行業(yè)中。真空冷凍干燥技術，它適宜于熱敏性及易氧化物質的干燥，被干燥的物料能保持原有的形態(tài),復水后易恢復原有的特性。利用該技術制備的乳酸菌干燥品具有便于貯藏、攜帶方便、復水性好等許多優(yōu)點。但是，要制備出單位重量含活菌數(shù)高、復水后活力強的高效濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑的粉狀制品,必須降低冷凍干燥過程對乳酸菌細胞膜的損傷作用。Woolford等（1984）在實驗室條件下檢測了21株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)了三株基本符合理想的青貯添加劑條件的乳酸菌菌株，分別為堅強鏈球菌（Streptococcus durans）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。因此,本試驗選擇植物乳桿菌作為菌種材料，通過研究添加不同冷凍干燥保護劑和不同保存溫度、保存時間對乳酸菌冷凍保存活菌量的影響，以篩選出效果較好的植物乳桿菌冷凍干燥保護劑和保存的溫度，為乳酸菌青貯添加劑的開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），由南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)研究室提供。

1.1.2 細胞懸浮基質

細胞懸浮基質為20%的脫脂奶粉溶液 [脫脂奶粉（由內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司制造）溶于無菌蒸餾水，121℃高溫滅菌15 min。滅菌后于37℃培養(yǎng)24 h，檢查是否滅菌徹底，檢驗無菌后置于4℃冰箱中備用]。

1.1.3 復水溶液

復水溶液為20%的乳糖溶液（稱取乳糖溶于無菌蒸餾水，121℃高溫滅菌15 min，置于4℃冰箱中備用）。

1.1.4 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g/l、牛肉膏 10 g/l、酵母膏 5 g/l、檸檬酸三銨 2 g/l、葡萄糖 20 g/l、乙酸鈉 2 g/l、Tween-801 ml/l、K2HPO42 g/l、MgSO4·7H2O 0.58 g/l、MnSO4·4H2O 0.25 g/l，pH 值6.2，用于乳酸菌活化、擴大培養(yǎng)。

計數(shù)培養(yǎng)基（MRS固體培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g/l、牛肉膏 10 g/l、酵母膏 5 g/l、檸檬酸三銨 2 g/l、葡萄糖 20 g/l、乙酸鈉 2 g/l、Tween-801 ml/l、K2HPO42 g/l、MgSO4·7H2O 0.58 g/l、MnSO4·4H2O 0.25 g/l，pH 值6.2，加1%的瓊脂，用于乳酸菌計數(shù)。

1.1.5 保護劑

10%海藻糖、20%蔗糖、5%谷氨酸鈉、10%乳糖、55%山梨醇。

1.2 儀器與設備

感量電子分析天平（上海分析儀器廠生產(chǎn)）、CH801型超凈工作臺（天津醫(yī)療凈化設備廠生產(chǎn)）、GO1-280型壓力蒸汽滅菌鍋（成都醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、CS101-A型電熱鼓風干燥箱（重慶試劑設備廠生產(chǎn)）、冷凍離心機（Beckman coulter公司生產(chǎn)）、真空冷凍干燥機（KINETICS公司生產(chǎn)），其它為實驗室常用設備。

1.3 研究方法

1.3.1 植物乳桿菌粉劑制備和保存工藝路線

植物乳桿菌經(jīng)過數(shù)代活化液體培養(yǎng)基培養(yǎng)→擴大液體培養(yǎng)基培養(yǎng)→離心收集菌體細胞、制備植物乳桿菌懸浮液→加冷凍干燥保護劑→分裝、冷凍干燥→檢驗→保存、檢驗。

1.3.2 乳酸菌懸浮液的制備

良好保存的植物乳桿菌菌種經(jīng)過數(shù)代活化后擴大培養(yǎng)至靜止期或成熟期，用冷凍離心機離心收集菌體細胞，制備懸浮液，收藏備用。

1.3.3 冷凍干燥

往經(jīng)高溫滅菌過的培養(yǎng)皿（d=9 cm）中加入20%的脫脂奶粉溶液、保護劑和乳酸菌懸浮液各5 ml后，在-20℃下預冷凍12 h，然后在充分預冷的冷凍干燥機里干燥7 h左右，直至樣品溫度接近室溫。

1.3.4 儲存試驗

冷凍干燥后的乳酸菌粉立即取樣測定活菌量，其余的分別保存于4和25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，定期取樣測定活菌量。

1.3.5 活菌數(shù)測定

采用稀釋平板活菌計數(shù)法，即在無菌操作條件下，將充分攪勻的檢樣吸取1 ml，加入無菌蒸餾水中，制成1：10的均勻稀釋液；再依次進行10倍遞增稀釋，至適當稀釋度。吸取1 ml置于滅菌培養(yǎng)皿中，然后倒入約15 ml水至50℃左右的計數(shù)培養(yǎng)基，搖勻。凝固后置于37℃，培養(yǎng)48 h，計平板上的菌落數(shù)。

1.3.6 存活率的測定

精確稱取待測菌粉0.02 g，加入40 ml 20%的乳糖溶液室溫下復水30 min，再進行活菌數(shù)測定。

2 結果與分析

2.1 保護劑對冷凍干燥過程乳酸菌存活率的影響

植物乳桿菌菌種經(jīng)過數(shù)代活化，再擴大培養(yǎng)至靜止期或成熟期后離心收集菌體細胞，按1：1：1的比例取菌體細胞懸浮液、懸浮基質和保護劑各5 ml加入滅菌的培養(yǎng)皿中，混勻，在-20℃下預冷凍12 h，然后在充分預冷的冷凍干燥機里干燥7 h左右得到的植物乳桿菌菌粉的存活率結果見表1。

表1 保護劑對植物乳桿菌冷凍干燥存活率的影響（%）

由表1可以看出，加入保護劑均能顯著提高乳酸菌的存活率，保護劑對乳酸菌的保護作用大小順序為：海藻糖>蔗糖>谷氨酸鈉>乳糖>山梨醇。海藻糖、谷氨酸鈉、山梨醇、乳糖和蔗糖與空白對照間比較有極顯著差異（P＜0.01），海藻糖與蔗糖、谷氨酸鈉、乳糖、山梨醇間均有極顯著差異（P＜0.01），蔗糖與谷氨酸鈉、乳糖、山梨醇間有顯著差異（P＜0.05），谷氨酸鈉與乳糖、山梨醇間有顯著差異（P＜0.05），而山梨醇和乳糖處理間差異不顯著(P＞0.05)，其中，海藻糖的保護作用最顯著，存活率達78.90%，比空白提高了38.53個百分點，植物乳桿菌的存活率幾乎增加一倍。

2.2 保護劑對乳酸菌冷凍干燥菌粉貯存過程存活率的影響

青貯添加劑有一定的壽命，本試驗對添加了不同保護劑制得的植物乳桿菌粉在4℃和25℃條件下進行貯存，表2和表3為不同保存期的植物乳桿菌存活率方差分析結果。

表2 不同保護劑對植物乳桿菌在4℃下貯存存活率的影響(%)

表3 不同保護劑對植物乳桿菌在25℃下貯存存活率的影響(%)

由表2可知，在貯存溫度為4℃時，隨著貯存天數(shù)的增加,各處理的植物乳桿菌存活率均不斷減低。其中,空白對照組在4℃保存30 d以內的植物乳桿菌存活率變化不顯著,30 d后乳酸菌死亡速度加快。海藻糖對冷凍干燥植物乳桿菌的保護作用相對最強,但在15、30、60 d 存活率下降速度快,差異極顯著(P＜0.01)。谷氨酸鈉在保存15 d和30 d時乳酸菌存活率差異不顯著(P＞0.05),而后開始加速死亡。山梨醇處理的植物乳桿菌存活率變化趨勢大致與谷氨酸鈉相同。乳糖處理在整個保存過程中存活率變化極顯著(P＜0.01)。蔗糖處理15 d與30 d時變化不顯著(P＞0.05)。

貯存溫度為4℃時，同一貯存時間上，15 d時除了谷氨酸鈉和乳糖差異不顯著(P＞0.05)外，其他處理間存活率差異都較顯著。30 d時山梨醇與乳糖處理差異不顯著(P＞0.05),其他處理差異均極為顯著(P＜0.01)。60 d時，空白及各處理間差異極顯著（P＜0.01）。

由表3可知,在貯存溫度為25℃時,隨著貯存天數(shù)的增加,各處理的植物乳桿菌存活率均不斷降低,空白對照組在25℃下保存,植物乳桿菌存活率隨保存時間增加顯著降低，15、30、60 d 間均有顯著差異(P＜0.05)；海藻糖對冷凍干燥植物乳桿菌的保護作用相對最強，但在15、30、60 d存活率下降速度快，差異極顯著（P＜0.01）；谷氨酸鈉、山梨醇、乳糖、蔗糖處理的植物乳桿菌存活率變化趨勢大致與海藻糖相同，在不同時間測定的植物乳桿菌存活率均有顯著差異（P＜0.05）。

25℃保存的結果分析表明，在15 d和30 d時空白對照處理及保護劑處理組間差異極顯著（P＜0.01）。60 d時，除谷氨酸鈉和蔗糖處理間差異不顯著（P＞0.05），空白對照和其他保護劑處理組間差異極顯著（P＜0.01）。

由表2和表3中結果比較可以看出，在4℃下保存植物乳桿菌的存活率變化較25℃下緩慢，其中，海藻糖對降低乳桿菌死亡率的效果相對較好。

3 討論

3.1 保護劑在植物乳桿菌冷凍干燥過程中的保護作用

對海藻糖、谷氨酸鈉、山梨醇、蔗糖和乳糖5種保護劑及空白對照組的植物乳桿菌冷凍干燥保護效果的比較研究結果表明，5種保護劑對植物乳桿菌均有明顯的保護作用，其中海藻糖的作用最明顯，達78.90%，比空白提高了38.53個百分點，活菌率幾乎增加了1倍，其次是蔗糖、谷氨酸鈉、山梨醇和乳糖的效果相當。

微生物的真空冷凍干燥分3個步驟進行。首先是預凍過程，預凍的速度與溫度根據(jù)微生物的種類而定。在這個過程中微生物體內的游離水凍結為小冰晶，冰晶體對微生物的細胞有機械損傷作用。研究結果表明，預凍增大了細胞膜的通透性，破壞了細胞膜的結構，其破壞程度與細胞膜內非飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的值有關。其次是升華過程，將預凍好的微生物置于高真空度的環(huán)境中，冰晶吸熱而直接變成水蒸氣從微生物體內逸出。升華過程是由內向外逐漸推移的，冰晶升華后在微生物體內留下許多微孔隙。再次是解析過程，這一過程使得殘留在微生物體內的結合態(tài)水解析出來，進一步降低微生物體內水分的含量。

但是冷凍干燥對菌細胞有很大傷害，為了提高微生物真空冷凍干燥后細胞存活率和穩(wěn)定性，常在冷凍時加入保護劑。保護劑的保護作用與它們的化學結構有著密切的關系，如低分子糖和低分子醇，它們具有多個羥基，這些羥基可以與細胞表面的自由基聯(lián)結起來，使細胞表面形成一層保護層，避免其直接暴露于外界。保護劑表面的羥基還可以與細胞表面的蛋白質形成氫鍵以取代水，增強細胞蛋白質的穩(wěn)定性。另外這些保護劑可以作為支持物和受體在復水過程中為干物質提供一定的骨架結構，在冷凍干燥過程中包圍在活細胞外，起到保護活細胞的作用。在適宜的冷凍干燥保護基質中凍干的菌體形態(tài)變化不大，菌表面呈腦回皺褶。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖（Trehalose）也是一種很好的活性物質保護劑，它是由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子經(jīng)α，α-1，1鍵聯(lián)結而成的非還原性雙糖，有較大的水化體積，能競爭更多的蛋白質水化層中的水，使蛋白質結構更為緊密，不易受到外界不利環(huán)境的影響，研究表明，海藻糖具有穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構、抗逆保鮮的作用，能在高溫、干燥失水等惡劣條件下在細胞表面形成特殊的保護膜，有效地保護生物分子結構不被破壞，降低干燥過程對細胞膜、脂質體等的傷害作用。

海藻糖對生物分子的保護作用，提出了種種假說，其中一種稱為“水替代”假說，該假說的依據(jù)是生物大分子物質周圍均包圍著一層水膜，對維持大分子的結構和功能是必不可少的，當生物大分子失去維持其結構和功能特性的水膜時，海藻糖能在失水部位以氫鍵形式連接，形成一保護膜以代替失去的結構水膜。

3.2 保護劑在植物乳桿菌粉劑貯存過程中的保護作用

添加了不同保護劑制得的植物乳桿菌粉在4℃和25℃條件下進行貯存表明：隨著溫度的升高，植物乳桿菌的死亡率增加，即在4℃條件下貯存的植物乳桿菌存活率高于25℃條件下的存活率；隨著保存時間的延長植物乳桿菌的死亡速度加快，海藻糖的作用優(yōu)于其他保護劑。

乳酸菌經(jīng)過干燥處理，但由于粉劑中仍然含有一定量的水分，在保藏過程中，殘留的水容易與蛋白質分子形成氫鍵，使細胞中蛋白質的穩(wěn)定性降低而容易變性，從而導致細胞的活力降低甚至死亡。從試驗結果可以看出，加入分子中含多羥基的保護劑后，細胞的存活率有所提高，這是因為保護劑的羥基可與細胞表面的蛋白質形成氫鍵以取代水，增強了細胞蛋白質的穩(wěn)定性。

4 結論

4.1 對海藻糖、谷氨酸鈉、山梨醇、蔗糖和乳糖5種保護劑的冷凍保護效果的比較研究表明，5種保護劑對植物乳桿菌均有明顯的保護作用，其中海藻糖的作用最明顯。

4.2 添加了不同保護劑制得的植物乳桿菌粉在4℃和25℃條件下進行貯存表明：4℃條件下貯存的植物乳桿菌存活率高于25℃條件下的存活率；隨著保存時間的延長植物乳桿菌的死亡速度加快，海藻糖的作用優(yōu)于其他保護劑。

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