甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物和免疫機(jī)能的影響

李路勝 周響艷

甘露聚糖類物質(zhì)作為半纖維素的第二大組分，是抗?fàn)I養(yǎng)因子非淀粉多糖的主要組成成分，它能結(jié)合大量水分，增加機(jī)體消化道內(nèi)容物的粘稠度，降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率；養(yǎng)分消化吸收不良，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)蓄積，給細(xì)菌在腸道大量定居提供了條件，影響動(dòng)物健康。β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露寡糖和甘露多糖的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類。β-甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解為甘露寡糖等低聚糖，不僅消除了甘露聚糖對單胃動(dòng)物各種營養(yǎng)素的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時(shí)生成的甘露低聚糖在動(dòng)物健康方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。甘露寡糖可以通過與腸絨毛免疫細(xì)胞表面蛋白受體相互作用或通過干預(yù)存在于淋巴結(jié)和粘膜固有層記憶細(xì)胞上的信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。經(jīng)研究表明，飼料中添加甘露寡糖可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力。許多關(guān)于肉仔雞的試驗(yàn)顯示,甘露寡糖可提高疫苗抗體滴度。

甘露聚糖酶在肉雞上的應(yīng)用已有多種報(bào)道，但多集中于直接添加和生產(chǎn)性能的考察，對于在日糧調(diào)整情況下免疫機(jī)能的考察報(bào)道較少，本試驗(yàn)旨在研究在降低日糧能量的情況下，添加β-甘露聚糖酶對肉雞免疫機(jī)能的影響，為 β-甘露聚糖酶在玉米-豆粕型日糧中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用甘露聚糖酶由東莞泛亞太生物科技有限公司提供，酶活性2000 U/g，推薦飼料添加量500 g/t。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

于山東聊城某肉雞場選取1日齡健康的817雜交肉雞720只，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只。試驗(yàn)時(shí)間為20 d。試驗(yàn)分為正對照組（常規(guī)日糧）、負(fù)對照組（低能日糧）、試驗(yàn)Ⅰ組（常規(guī)日糧+500 g/t甘露聚糖酶）和試驗(yàn)Ⅱ組（低能日糧+500 g/t甘露聚糖酶）。

1.3 試驗(yàn)日糧

按照817雜交肉雞的營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制玉米-豆粕型日糧，日糧配方組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧配方組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

按照本試驗(yàn)雞場的常規(guī)管理程序進(jìn)行免疫和日常管理，采用地上平養(yǎng)方式進(jìn)行飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每天定時(shí)投料。每天仔細(xì)觀察和記錄雞只的健康狀況和糞便情況，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)處理，每組分別記錄死亡雞只數(shù)。

1.5 免疫機(jī)能的測定

在20日齡時(shí)，從每個(gè)處理組隨機(jī)抽選12只雞，無菌心臟采血2 ml，立即注入真空肝素鈉采血管中，搖勻后立即放入冰盒，抽血完畢立即送實(shí)驗(yàn)室做淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

心臟采血后，重新選擇12只雞，頸靜脈采血約10 ml，裝入15 ml塑料離心管中，傾斜放置，讓血液自然凝固，在血凝后0.5 h內(nèi)以4000 r/min離心15 min，分離血清，吸出上層血清放入-20℃冰箱中冷凍保存，測定新城疫HI含量。

頸靜脈采血后將雞只屠宰，剝離脾臟、法氏囊和胸腺，稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.6 腸道內(nèi)容物指標(biāo)測定

采血后屠宰的雞只,無菌采集回腸和盲腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。提取肉雞相應(yīng)腸段的內(nèi)容物,在未解凍前用分析天平稱重,然后按質(zhì)量體積比為1：2的比例加入4℃的生理鹽水,在低溫下勻漿(冰浴中)30 s,然后用低溫離心機(jī)將勻漿液在10000 r/min、4℃條件下離心15 min,取上清液若干后等分,-20℃條件下保存?zhèn)溆么郎y。各微生物指標(biāo)的測定均按照常規(guī)方法進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差與協(xié)方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶對肉雞免疫機(jī)能的影響（見表2）

表2 各處理組肉雞20日齡免疫機(jī)能的變化

由表2可以看出，試驗(yàn)Ⅱ組的胸腺指數(shù)與負(fù)對照組相比明顯提高了29.70%，差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組與負(fù)對照組相比雖差異不顯著，但也增加了10.30%，兩試驗(yàn)組與正對照組相比差異不顯著（P＞0.05），從脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)上看，兩試驗(yàn)組與正、負(fù)對照組相比均有提高的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

從新城疫抗體上看，試驗(yàn)Ⅱ組的HI水平明顯高于負(fù)對照組，提高幅度為7.44%（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組與負(fù)對照相比有提高的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），兩試驗(yàn)組與正對照組相比差異不顯著；試驗(yàn)Ⅱ組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比正、負(fù)對照組分別提高了6.91%和8.56%（P＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組與正、負(fù)對照組相比無顯著差異（P＜0.05）。

2.2 甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物菌群的影響（見表3）

表3 各處理組肉雞20日齡腸道微生物菌群的變化（Lg CFU/g濕重）

由表3可以看出，與正、負(fù)對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組均降低了回腸大腸桿菌數(shù)量、提高了乳酸桿菌的數(shù)量，雖差異不顯著（P＞0.05），但均有改善的趨勢。

從盲腸上看，與負(fù)對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組均可顯著減少大腸桿菌數(shù)量（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅰ組與正對照組相比降低了6.5%（P＞0.05），雖然差異不顯著，但有降低的趨勢。與正、負(fù)對照組相比較，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組均顯著提高了乳酸桿菌的數(shù)量，其中試驗(yàn)Ⅰ組比正對照組提高了6.2%，試驗(yàn)Ⅱ組比負(fù)對照組提高了9.9%，均差異顯著（P＜0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加甘露聚糖酶可明顯改善肉雞回腸和盲腸的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，盲腸改善效果比回腸明顯。

2.3 甘露聚糖酶對肉雞腸道pH值的影響（見表4）

表4 各處理組肉雞20日齡腸道pH值的變化

從表4可以看出，添加甘露聚糖酶可顯著降低盲腸內(nèi)容物pH值，試驗(yàn)Ⅱ組比負(fù)對照組降低了5.2%，試驗(yàn)Ⅰ組比正對照組降低了6.0%，均差異顯著（P＜0.05）。與相應(yīng)對照組相比，十二指腸、空腸和回腸pH值均有降低的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 甘露聚糖酶對肉雞免疫機(jī)能的影響

免疫細(xì)胞在家禽的免疫系統(tǒng)中非常重要，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起主要作用的是淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、N細(xì)胞、K細(xì)胞以及免疫應(yīng)答過程中的過渡型細(xì)胞和終末的效應(yīng)細(xì)胞?？乖兔庖呒?xì)胞相互作用，產(chǎn)生由激活細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和由抗體產(chǎn)生介導(dǎo)的體液免疫。對T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、抗體水平的度量或細(xì)胞功能如吞噬活性等的研究，可用以評價(jià)免疫系統(tǒng)的狀態(tài)（Perdigon，1995）。許多研究表明，β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖類物質(zhì)產(chǎn)生甘露寡糖，甘露寡糖可以通過與腸絨毛免疫細(xì)胞表面蛋白受體相互作用或通過干預(yù)存在于淋巴結(jié)和粘膜固有層記憶細(xì)胞上的信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)（Savvage等，1996），飼料中添加甘露寡糖可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力（Nathan等，1993），提高疫苗抗體滴度（Spring，1998）。宋智娟等（2007）報(bào)道，添加甘露聚糖酶可增加肉雞免疫器官指數(shù)。

本試驗(yàn)通過T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)來對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行度量，通過對ND抗體水平的檢測來檢測益生素的免疫佐劑功能，通過檢測免疫器官指數(shù)來比較免疫器官的發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)在低能日糧中添加甘露聚糖酶可明顯提高肉雞的胸腺指數(shù)和新城疫抗體水平，常規(guī)日糧添加甘露聚糖酶對胸腺指數(shù)和新城疫抗體雖差異不顯著，但均有提高的趨勢，從淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率上看，添加甘露聚糖酶基本無影響。說明添加甘露聚糖酶可提高肉雜雞的免疫機(jī)能，從使用方法上看，日糧營養(yǎng)水平越低，加酶的效應(yīng)越大。

3.2 甘露聚糖酶對腸道微生物菌群的影響

甘露聚糖酶可降解豆粕中甘露聚糖，產(chǎn)生甘露寡糖。甘露寡糖是一種端基含甘露糖的寡糖，類似腸細(xì)胞的受體，可通過阻斷細(xì)菌同腸粘膜上皮細(xì)胞特異性糖分子受體黏接，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道pH值等方式，促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸桿菌的生長繁殖，抑制有害菌的定植和生長。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加甘露聚糖酶明顯降低了盲腸大腸桿菌數(shù)量，提高了乳酸桿菌數(shù)量（P＜0.05），回腸微生物菌群雖然各組間差異不顯著，但均有改善的趨勢（P＞0.05）,這與宋智娟等（2007）的研究基本一致。

3.3 甘露聚糖酶對腸道pH值的影響

甘露聚糖酶降解甘露聚糖產(chǎn)生的甘露寡糖在動(dòng)物消化道被微生物發(fā)酵，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，從而降低腸道pH值。pH值降低可抑制大腸桿菌的生長，促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖。而雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌又可將腸道中的可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)變成醋酸和乳酸，因此又降低了腸道環(huán)境的pH值。宋智娟等在日糧中添加不同水平的甘露聚糖酶，均顯著降低了肉雞盲腸的pH值。本試驗(yàn)分別對十二指腸、空腸、回腸和盲腸進(jìn)行了pH值測定，結(jié)果表明添加甘露聚糖酶顯著降低了盲腸內(nèi)容物pH值，試驗(yàn)Ⅱ組比負(fù)對照降低了5.2%，試驗(yàn)Ⅰ組比正對照降低了6.0%，均差異顯著（P＜0.05）；十二指腸、空腸和回腸雖有降低的趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05），這可能與消化道微生物數(shù)量分布有關(guān)。

4 結(jié)論

在肉雞玉米-豆粕型日糧中降低0.33 MJ/kg能量進(jìn)行配方調(diào)整的情況下，低能日糧添加甘露聚糖酶的免疫效果比常規(guī)日糧加酶更顯著。添加甘露聚糖酶還可以改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)，降低盲腸pH值。

[1]Perdigon G,S.Alvarez,M.Rachid,et al.Immune system stimulation by probiotics[J].Journal of Dairy Science,1995,78:1597-1606.

[2]T F Savage,P F Cotter,E I Zakrzewska.The effect of feeding amannan oligosaccharide on immunoglobulins,plasma IgG and bile IgA of wrolstad MW male turkeys[J].Poultry Sci.,1996,75(1):143.

[3]Nathan Sharon,Halina Lis.Carbohydrates in cell recognition[J].Scientific American,1993(1):74-81.

[4]Spring P,Privulescu M.Mannoligosaccharide:its logical role as a natural feed additive for piglets[M].Proceedings of alltech's 14th annual symposium,United Kingdom:Nottinghan University Press,1998:553-561.

[5]宋智娟，張艷銘，廖智慧.β-甘露聚糖酶對肉雞腸道內(nèi)微生物菌群及pH值的影響[J].飼料工業(yè)，2007,28(22):14-17.

[6]王冉,邵春榮,胡來根,等.低聚糖對肉雞腸道內(nèi)主要微生物菌群數(shù)量的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,18(3):159-162.

[7]周映華,張石蕊.甘露寡糖對肉雞生產(chǎn)性能和腸道微生物以及免疫機(jī)能的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,29(3):250-253.

[8]于桂陽,張昊,鄭春芳.甘露寡糖對肉雞腸道微生物的影響[J].獸藥與飼料添加劑,2004,9(5):7-9.

[9]周仲愷.新型飼料添加劑——功能性低聚糖[J].廣東飼料,1999(1):29-32.

[10]盧建軍.寡聚糖在飼料工業(yè)上的應(yīng)用[J].飼料與畜牧,1999(1)：21-22.

[11]邵良平,周倫江,李國平,等.不同劑量甘露寡聚糖對雞細(xì)胞免疫和腸道微生態(tài)的影響[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,28(1):86-89.