缺氧條件下活性污泥中PHB的生物合成

李金娟，趙 林，譚 欣，黃 宇，德吉央宗，齊 云

缺氧條件下活性污泥中PHB的生物合成

李金娟，趙 林，譚 欣，黃 宇，德吉央宗，齊 云

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072)

在序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor，SBR)中馴化活性污泥，富集聚β-羥基丁酸酯(poly-βhydroxybutyrate，PHB)積累菌，并研究馴化后活性污泥的PHB合成能力．污泥馴化采用好氧動態(tài)供料法，為期3個月．PHB合成實驗在缺氧條件下進(jìn)行(通氣量為80.L/h，溶解氧為0.mg/L)，溫度為20.℃，活性污泥初始質(zhì)量濃度為1.200.mg/L，乙酸鈉質(zhì)量濃度為931.5.mg/L(以C計)．結(jié)果表明，馴化后活性污泥中PHB積累菌占優(yōu)勢，具有PHB合成的能力．投加乙酸鈉931.5.mg/L(C)，在缺氧條件下，活性污泥中PHB含量于feast(底物豐富)階段末達(dá)最高值45.4%．feast階段內(nèi)乙酸鈉消耗94%，其中53.4 %的乙酸鈉被轉(zhuǎn)化為PHB，2.7%乙酸鈉用于合成污泥活性生物量，供污泥生長．因此，好氧動態(tài)供料法馴化后的活性污泥具有較強(qiáng)的PHB合成能力，生長緩慢．

生物降解塑料；聚β-羥基丁酸酯；活性污泥；好氧動態(tài)供料法

聚β-羥基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是一種可以被生物降解的高分子聚合物，屬于聚羥基脂肪酸酯(poly-β-hydroxyalkanoate，PHA)類．PHB具有化學(xué)合成塑料的理化性質(zhì)，可紡絲、壓膜和注塑等，并且具有生物可降解性和生物相容性，在醫(yī)藥及工農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1-2]．現(xiàn)階段PHB的合成大多是利用純菌種微生物發(fā)酵法和基因工程法，生產(chǎn)成本較高．利用污水處理技術(shù)積累PHA[3]，同時實現(xiàn)污泥的資源化，成為一個新的研究熱點．

PHB是許多原核微生物在不平衡生長條件下合成的一種胞內(nèi)能源和碳源儲藏性物質(zhì)．研究發(fā)現(xiàn)，PHB在污水生物處理中是一種重要中間產(chǎn)物[4]，普遍存在于有機(jī)廢水處理活性污泥中．目前國內(nèi)對于活性污泥合成PHB的研究主要采用厭氧-好氧/生物除磷工藝[5]．國外研究大多以活性污泥為混合菌群，采用動態(tài)供料法使活性污泥處于非穩(wěn)態(tài)生長，合成PHB，但其都集中在好氧、厭氧條件下PHB的合成研究[6-8]，對于缺氧條件的研究較少．筆者利用好氧動態(tài)供料法馴化活性污泥，并在缺氧的條件下研究活性污泥利用乙酸鈉合成PHB的能力．

1 實驗方法

1.1實驗裝置及活性污泥馴化

實驗裝置由序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor，SBR)主體(有效容積8.L)、進(jìn)出水系統(tǒng)、攪拌曝氣系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集及控制系統(tǒng)4部分組成．進(jìn)出水系統(tǒng)由水泵、電磁排水閥及管路構(gòu)成；攪拌曝氣系統(tǒng)由電動攪拌機(jī)、空氣壓縮機(jī)、空氣擴(kuò)散器、氣體流量計及管路構(gòu)成；數(shù)據(jù)采集及控制系統(tǒng)由溶解氧(dissolved oxygen，DO)、pH電極及其控制器、數(shù)字式污水處理自動程序控制器和PC機(jī)組成．

活性污泥取自天津市紀(jì)莊子污水處理廠，采用好氧動態(tài)供料方法在SBRⅠ中對其進(jìn)行馴化培養(yǎng)．周期運(yùn)行方式為：進(jìn)水—曝氣+攪拌—加碳源—沉淀—瞬時出水，周期為12.h．進(jìn)水采用自配水，主要成分質(zhì)量濃度見表1．通過添加硫脲(20.mg/L)抑制硝化作用[9]．碳源(CH3COONa·3H2O)通過蠕動泵加入，使反應(yīng)器中CH3COONa·3H2O的質(zhì)量濃度約為300.mg/ L．通過預(yù)設(shè)程序?qū)ρh(huán)周期內(nèi)各階段進(jìn)行自動控制．每周期在好氧結(jié)束后排出400,mL活性污泥混合液，維持污泥齡為10,d．每周期活性污泥沉淀1.h排出3,L上清液．

表1 進(jìn)水成分Tab.1 Component of synthetic wastewater

1.2活性污泥中PHB的合成

取馴化后的活性污泥，加入到SBRⅡ反應(yīng)器，初始混合液懸浮固體(mixed liquor suspended solid，MLSS)質(zhì)量濃度為1,200,mg/L．進(jìn)水后曝氣攪拌1,h，瞬時投加碳源CH3COONa·3H2O,4,g/L，調(diào)節(jié)曝氣量80,L/h，溫度20,℃左右，pH值為7.5～8.5．實驗過程中定時取樣分析水樣乙酸鈉、MLSS、揮發(fā)性懸浮固體(volatile suspended solid，VSS)和PHB含量．

1.3分析測試與計算

采用總有機(jī)碳分析儀(島津TOC-VCPH) 測定乙酸鈉，分析結(jié)果以C計．MLSS和VSS測定采用干重法[10]．pH值、DO值利用pH電極、DO電極進(jìn)行在線監(jiān)測．PHB定性觀察采用蘇丹黑染色法[11]．

PHB含量的測定采用氣相色譜法[12-13]．分別取PHB標(biāo)準(zhǔn)品(Aldrich，美國)20,mg、冷凍干燥的活性污泥50.mg置于螺口試管中，加入2,mL氯仿、2,mL含3%硫酸以及2,mL含苯甲酸的甲醇溶液，100,℃水浴4 h；取出后在試管中加入2,mL去離子水并劇烈振蕩，待溶液靜止分層后取下層有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，進(jìn)行氣相色譜分析．氣相色譜條件為：采用Agilent 19091J-413型氣相色譜儀和火焰離子化檢測器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)，色譜柱為HP-IN NO WAX型石英毛細(xì)管柱(30,m×250.μm×0.25.mm)．進(jìn)樣口溫度為220,℃，檢測口溫度為250,℃，N2流量為45,mL/min，H2流量為40,mL/min，空氣流量為450.mL/min，進(jìn)樣量為1,μL，分流比為20∶1．采用程序升溫，升溫速度為15,℃/min；初溫為130,℃，保持2,min；終溫220,℃，保持2.min．

乙酸鈉比消耗速率、PHB比合成速率和乙酸鈉的PHB轉(zhuǎn)化率的計算參考文獻(xiàn)[6] ．

2 結(jié)果與分析

2.1污泥馴化

馴化過程中，瞬時投加少量碳源，使微生物處于底物豐富與匱乏的交替狀態(tài)(feast and famine state)，進(jìn)行非穩(wěn)態(tài)生長. 在這種動態(tài)生長環(huán)境下，具有PHB存儲能力的微生物在活性污泥系統(tǒng)中因更有競爭力而成為優(yōu)勢菌種．

污泥馴化周期內(nèi)乙酸鈉(以C計)和PHB的變化如圖1所示．由圖可以看出，投加乙酸鈉后，水相中C含量瞬時升高(由10.2,mg/L升高至62.8 mg/L)．在好氧條件下，活性污泥迅速利用有機(jī)碳源，C含量降低，1,h降至17,mg/L．活性污泥中PHB含量升高，1,h達(dá)到最高值，占活性污泥干重的12.4%．1,h后PHB迅速降解，2,h降至7.1%，3,h降至6.4%．

污泥馴化周期內(nèi)DO的變化見圖2．在好氧動態(tài)供料工藝中DO濃度變化明顯.從圖中可以看出，DO在加入碳源后很快減小，約在15,min時達(dá)到最低點．之后，由于曝氣復(fù)氧速率大于活性污泥耗氧速率，DO迅速上升．1,h后，活性污泥沒有可以利用的胞外碳源，開始代謝PHB，此時活性污泥耗氧速率約等于曝氣復(fù)氧速率，DO基本達(dá)穩(wěn)態(tài)．2 h后，大部分PHB被消耗，活性污泥代謝緩慢，DO迅速升高．因此通過在線監(jiān)測DO的變化，可辨別底物豐富和匱乏階段的拐點．

圖1 乙酸鈉濃度和活性污泥中PHB含量Fig.1 Acetate and PHB contents in activated sludge

圖2 DO的變化Fig.2 Change of DO

活性污泥染色顯微照片如圖3所示．可以看出，PHB積累菌經(jīng)蘇丹黑染色后為黑色，聚集為絮狀，在活性污泥系統(tǒng)中占優(yōu)勢地位．原因在于，在SBR反應(yīng)器中，微生物可以獲得胞外底物的時間相對比較短，底物被消耗后，沒有胞內(nèi)合成物的微生物很快進(jìn)入內(nèi)源呼吸期，生長緩慢；具有PHB儲藏能力的微生物在底物存在的情況下合成PHB，胞外底物消失后，則分解利用PHB繼續(xù)生長，因此要比沒有該能力的微生物更具競爭力，使得PHB積累菌在活性污泥系統(tǒng)中占優(yōu)勢．

圖3 活性污泥的蘇丹黑染色顯微照片(10×10)Fig.3 Micrograph of activated sludge stained by Sudan black(10×10)

2.2活性污泥中PHB的合成

PHB合成階段中DO含量與乙酸鈉變化趨勢見圖4．投加乙酸鈉后，活性污泥吸收利用乙酸鈉，消耗氧氣．由于活性污泥的耗氧速率大于曝氣復(fù)氧速率，溶解氧迅速耗盡，5,h內(nèi)一直處于未檢測出的狀態(tài)．在此階段內(nèi)，活性污泥處于缺氧狀態(tài)，通過氧化分解部分有機(jī)基質(zhì)來獲得能量，積累PHB．5,h后，有機(jī)碳源耗盡，活性污泥進(jìn)行內(nèi)源代謝，曝氣復(fù)氧速率大于活性污泥耗氧速率，溶解氧含量迅速上升．通過溶解氧的變化，即可判定5,h內(nèi)活性污泥處于底物豐富階段，5,h后活性污泥處于底物匱乏階段．

圖4 DO和乙酸鈉的變化Fig.4 Change of DO and acetate

PHB合成階段MLSS、VSS及PHB含量變化分析如下．在底物豐富階段，活性污泥儲存PHB；在底物匱乏階段，活性污泥消耗PHB，用作碳源和能源進(jìn)行生長．本文只討論底物豐富階段內(nèi)PHB的合成．由圖5可以看出，底物豐富階段內(nèi)(5,h內(nèi))活性污泥質(zhì)量濃度和PHB含量均呈增長趨勢．初始活性污泥質(zhì)量濃度MLSS為1,200,mg/L，PHB含量為109,mg/L，占污泥干重的9.1%；5,h時MLSS增長至2,080,mg/L，PHB含量增長至945,mg/L，占污泥干重的45.4%．圖6為VSS成分，VSS是揮發(fā)性固體，通常用于表示污泥中有機(jī)物含量，包括污泥活性生物量和儲藏物質(zhì)PHB兩部分．由圖6可以看出，在5,h內(nèi)，VSS和PHB呈增長趨勢：初始VSS質(zhì)量濃度為944.1,mg/L，5,h時VSS為1,813.7,mg/L；5,h內(nèi)VSS增長量為869.6,mg/L，而PHB的增加量為836,mg/L，因此VSS的增加主要是由PHB的合成引起的．而污泥活性生物量變化很小，初始為835.1,mg/L，5,h時為869.1,mg/L，5,h內(nèi)活性生物量增長量為34,mg/L．

圖5 MLSS及PHB含量的變化Fig.5 Change of MLSS and PHB

圖6 VSS的成分Fig.6 Component of VSS

乙酸鈉的消耗和PHB的合成關(guān)系見圖7．可以看出，乙酸鈉的消耗主要在5,h內(nèi)進(jìn)行，乙酸鈉質(zhì)量濃度(以C計)從初始的931.5,mg/L減少到56.7,mg/L，5,h內(nèi)乙酸鈉消耗量為874.8,mg/L，消耗速率為174.9,mg/(L·h)，比消耗速率為464,mg/ (mg·h)．在此階段，活性污泥主要利用乙酸鈉合成PHB，PHB的質(zhì)量濃度(以C計)從初始的60.8,mg/L升高至527.4, mg/L，PHB的增長量為466.6,mg/L，所以PHB的合成速率為93.32,mg/(L·h)，比合成速率為0.248,mg/(mg·h)．因此，底物豐富階段內(nèi)，乙酸鈉的PHB轉(zhuǎn)化率為53.4%．在本實驗中，乙酸鈉一部分被氧化分解，產(chǎn)生能量，供活性污泥利用，一部分用于儲藏PHB，只有很小一部分活性污泥自身生長(污泥活性生物量合成)．

圖7 乙酸鈉濃度和PHB含量的變化Fig.7 Change of acetate and PHB

乙酸鈉去除及PHB合成、污泥活性生物量合成三者關(guān)系如圖8所示．5,h內(nèi)乙酸鈉消耗量為874.8,mg/L(C)，其中PHB合成量為466.6,mg/L(C)，占乙酸鈉消耗量的53.4%；污泥細(xì)胞成分合成量為23.9,mg/L(C)，占乙酸鈉消耗量的2.7%．

圖8 乙酸鈉的去除Fig.8 Removal of acetate

3 結(jié) 論

(1)好氧動態(tài)供料法馴化活性污泥，使活性污泥處于底物豐富與匱乏的交替狀態(tài)，長時間的底物匱乏使PHB合成菌在活性污泥中更具競爭力，得到富含PHB合成菌的活性污泥.

(2)反應(yīng)周期內(nèi)，底物豐富階段活性污泥利用胞外碳源乙酸鈉合成PHB，PHB含量升高；底物匱乏階段活性污泥降解利用PHB．所以，PHB含量于底物豐富階段末達(dá)最高值．通過在線觀察DO的變化，可辨別底物豐富和底物匱乏階段的拐點，確定PHB合成的最佳時間．

(3)在高濃度乙酸鈉(以C計，931.5,mg/L)條件下，溶解氧成為活性污泥代謝的限制因素，在低通氧量的條件下，活性污泥主要進(jìn)行儲藏物的合成，進(jìn)行非平衡生長，污泥活性生物量增長緩慢．在底物豐富階段內(nèi)，活性污泥消耗乙酸鈉874.8,mg/L，合成PHB 466.6,mg/L，合成污泥活性生物量45,mg/L．所以在缺氧條件下，乙酸鈉主要用來合成PHB，乙酸鈉的PHB轉(zhuǎn)化率為53.4%．

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Biosynthesis of Poly-β-Hydroxybutyrate in Activated Sludge Under Anoxic Oxygen Condition

LI Jin-juan，ZHAO Lin，TAN Xin，HUANG Yu，DEJI Yang-zong，QI Yun
(School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

Activated sludge has been domesticated by aerobic dynamic feeding for 3 months in sequencing batch reactor (SBR)，which is rich in poly-β-hydroxybutyrate(PHB)-accumulating microorganisms，and its PHB biosynthesis capacity has been studied. The PHB synthesis experiments were conducted under anoxic oxygen condition(air flow rate 80 L/h，dissolved oxygen 0 mg/L)at 20.℃ with the initial concentration of mixed liquor suspended solid (MLSS) and acetate being1 200 mg/L and 931.5 mg/L(C) respectively. Experiment results indicate that PHB-accumulating microorganisms with PHB synthesis capacity predominate in the activated sludge after domestication. After feeding of acetate dosage of 931.5 mg/L(C)，PHB content in the sludge reached the maximum value of 45.4% at the end of feast(external substrate accessibility)period under anoxic oxygen condition. During the feast period，94% of acetate was consumed，in which 53.4% of acetate was transformed to PHB and 2.7% of acetate was used to synthesize cell structural materials for sludge growth. It is thus concluded that the activated sludge after domestication by aerobic dynamic feeding has a high PHB synthesiscapacity and grows slowly.

biodegradable plastics；poly-β-hydroxybutyrate；activated sludge；aerobic dynamic feeding

X703

A

0493-2137(2010)01-0050-05

2008-11-25；

2009-03-18.

李金娟（1981— ），女，博士研究生，jinjuanli1981@yahoo.com.cn．

趙 林，zhaolin@tju.edu.cn．