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    補腎安胎方及其拆方對控制性超排卵小鼠胚胎著床干預(yù)的比較*

    2010-06-06 06:25:38孟艷岑張明敏
    中西醫(yī)結(jié)合研究 2010年6期
    關(guān)鍵詞:安胎床位胚胎

    賈 研 孟艷岑 張明敏

    華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,武漢 430030

    控制性超排卵(COH)是目前常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程的重要步驟,旨在用大量的促性腺激素促進(jìn)卵巢功能,以獲得多個可供選擇的卵泡,但目前各種控制性超排卵方案均極影響子宮內(nèi)膜環(huán)境,使得胚泡著床率低下,而以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)的復(fù)方在改善子宮內(nèi)膜容受性上具有其獨特的優(yōu)勢。由菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷、丹參、黃芪、當(dāng)歸組成的補腎安胎方多次運用于臨床IVF-ET技術(shù)失敗的患者,有提高孕育成功率的作用。前期的研究[1-2]表明,該方可以通過多種分子機制,如提高雌二醇(E2)、孕酮(P)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、白血病抑制因子(LIF)等的表達(dá),改善內(nèi)膜功能,促進(jìn)控制性超排卵小鼠的胚胎著床,但其各組分的具體作用尚需進(jìn)一步明確?;诖?我們對補腎安胎方及其補腎、活血組分進(jìn)行比較,觀察全方及其拆方對子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子圍著床期類肝素結(jié)合表皮生長因子(HBEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)的影響,探討各組分間是否具有選擇和協(xié)同作用,為中醫(yī)補腎方、活血方改善胚泡著床機制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗對象

    選用健康清潔級昆明小鼠,雌性未交配過,雄性證明有生育能力,鼠齡10~12周,體重28~32 g(湖北省衛(wèi)生防疫站提供),置于室溫18~22℃,10 h光照,14 h暗室,相對濕度70%~85%的動物房內(nèi),雌雄分籠飼養(yǎng),自由攝食,飲水。

    1.2 藥物及試劑

    補腎方由菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷組成;活血方由黃芪、當(dāng)歸、丹參組成;補腎安胎方則為上述兩方相加,3種方劑按一定比例制成含生藥量1.45 g/ml的無菌煎劑,密封,4℃保存。注射用孕馬血清(PMSG)選自杭州動物藥品廠;注射用絨毛膜促性腺激素(HCG)選自上海麗珠制藥;伊文思藍(lán)染色試劑選自南京奧多福尼生物科技有限公司;免疫組織化學(xué)試劑:HB-EGF多克隆抗體(Santa cruze,USA)、兔抗羊二抗SP試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);RT-PCR試劑:T rizol RNA抽提試劑(Gibcobr,USA)、Taq DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶及其反應(yīng)緩沖液、Oligo(Dt)18、dNTP、RNasin 酶抑 制劑(Promega,USA)、PCR Marker(Ferment,USA)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 分組及處理 將小鼠隨機分為正常組(N)、模型組(M)、補腎安胎組(BH)、補腎組(BS)和活血組(HX),連續(xù)觀察兩個動情周期正常。模型組和中藥各組于05∶00 PM腹腔注射PMSG 10 IU,48 h后腹腔注射 HCG 10 IU,于注射HCG當(dāng)晚按雌雄比例1~2∶1合籠;正常組不經(jīng)控制性超排卵而合籠。模型組和正常組于注射PMSG當(dāng)日起,每日08∶00 AM灌服雙蒸水0.3 ml;中藥各組均灌服中藥0.3 ml。合籠后次日07∶00~08∶00 AM 檢查雌鼠陰道,發(fā)現(xiàn)陰栓者計為妊娠第1天。

    1.3.2 標(biāo)本收集 于妊娠第5天、第6天的07∶00 PM向小鼠尾靜脈注射0.1 ml 0.5%伊文思藍(lán),15 min后頸椎脫臼處死小鼠,剖腹取子宮。被伊文思藍(lán)染為深藍(lán)色部位為小鼠胚胎著床位點。剪取一半子宮置于-80℃冰箱用于RT-PCR,另一半置于4%的多聚甲醛中固定12 h后,送同濟醫(yī)院病理科石蠟包埋切片。

    1.3.3 小鼠陰栓率、妊娠率、著床位點數(shù)檢測 小鼠合籠后次日清晨查陰栓,有陰栓者即為陽性并記數(shù);妊娠第6天,剖腹取子宮后,記錄各組妊娠鼠數(shù)和孕鼠著床位點數(shù)。

    1.3.4 妊娠第6天小鼠胚泡實物圖觀察 于妊娠第6天取子宮標(biāo)本后,將妊娠子宮對稱平鋪于清潔玻璃培養(yǎng)皿中,拍照。

    1.3.5 HB-EGF mRNA表達(dá)測定 采用Trizol試劑提取細(xì)胞及組織總 RNA,取模板RNA 1 μ g加入Oligo(Dt)18,70℃變性5 min后迅速置冰上冷卻2 min,加入MMLV反轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)緩沖液、RNasin酶抑制劑、dNTP,42℃60 min后,70℃10 min進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR。根據(jù)Primer 6.0軟件設(shè)計引物序列:HB-EGF上游引物:5′-GCAGCGGACAGTGCCT TAG-3′,下游引物 :5′-CCCGTGGATGCAGTAGTG-3′,擴增產(chǎn)物長度為478 bp。以β-actin作為內(nèi)參照,上游引物:5′-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3′, 下 游 引 物 為:5′-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′,擴增產(chǎn)物長度為570 bp。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸90 s,進(jìn)行29個循環(huán),最后1個循環(huán)后,72℃延伸10 min。分別取HB-EGF和β-actin PCR 產(chǎn)物 5 μ l加 6×上樣緩沖液 1 μ l,1.7%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,30 min),然后用凝膠成像系統(tǒng)(上海培清)成像,再用Quantity One軟件,分析各條帶灰度值,得LIF/β-actin的灰度比值,即為LIF mRNA的相對表達(dá)值。

    1.3.6 EGFR蛋白表達(dá)測定 按照SP試劑盒說明步驟行SP染色,以一抗來源的血清代替一抗作陰性對照。光鏡下結(jié)果判定:細(xì)胞胞質(zhì)染成淡黃至棕黃為陽性細(xì)胞標(biāo)志,每張切片在光鏡下隨機選取5個不同視野,以切片染色的背景作對照,采用HPIAS 1000病理圖文分析系統(tǒng)(同濟醫(yī)學(xué)院千屏影像公司)分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 5組小鼠陰栓率、妊娠率和胚胎著床位點數(shù)比較

    與正常組比較,模型組陰栓率、妊娠率顯著降低(P<0.01),著床位點顯著增多(P<0.01);各中藥組著床位點數(shù)較模型組降低,但陰栓率、妊娠率顯著升高,補腎安胎組均較活血組和補腎組顯著(P<0.05,P<0.01);陰栓率活血組優(yōu)于補腎組(P<0.05),著床位點數(shù)活血組低于補腎組(P<0.01),但活血組和補腎組妊娠率無明顯差異(P>0.05)。見表1。

    表1 各組小鼠陰栓率、妊娠率和胚胎著床位點數(shù)比較(±s)

    表1 各組小鼠陰栓率、妊娠率和胚胎著床位點數(shù)比較(±s)

    與正常組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01;與補腎安胎組比較△P<0.05,△△P<0.01;與補腎組比較□P<0.05,□□P<0.01

    組別 n 陰栓陽性數(shù)(只,%) 妊娠數(shù)(只,%) 著床位點數(shù)(個/只)正常組 36 29(80.56) 29(100.00) 14.55±1.74模型組 36 19(52.78)** 15(78.95)** 23.76±5.36**補腎安胎組 35 26(74.29)## 24(92.31)## 16.64±2.71##補腎組 37 23(62.16)##△ 20(86.96)##△△ 20.17±2.79##△△活血組 36 25(69.44)##△□ 23(88.46)##△ 18.95±4.44##△△□□

    2.2 妊娠第6天小鼠胚泡實物圖觀察

    實物大體觀察顯示:正常組小鼠胚泡呈串珠狀,均勻分布于兩側(cè)子宮,伊文思藍(lán)著色均勻,胚泡大小均一,發(fā)育良好。模型組小鼠胚泡數(shù)多,大小不等,分布不均,伊文思藍(lán)著色深淺不一,有大量相互融合的胚泡。各中藥組小鼠胚泡數(shù)較模型組少,大小及分布較模型組均勻,但不及正常組胚泡。其中補腎安胎組胚泡呈串珠狀,大小及分布均較補腎組、活血組均勻,伊文思藍(lán)著色較接近正常組;補腎組和活血組之間比較,活血組胚泡分布及著色均較補腎組顆大、均勻;補腎組胚泡亦有融合現(xiàn)象。見圖1。

    圖1 各組小鼠妊娠第6天著床位點實物圖(伊文思藍(lán)染色)

    2.3 各組小鼠妊娠第5天、第6天子宮內(nèi)膜HB-EGF mRNA的表達(dá)

    模型組子宮內(nèi)膜HB-EGF mRNA的表達(dá)顯著低于正常組(P<0.01),中藥各組治療后HB-EGF mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。補腎活血組HBEGF mRNA的表達(dá)明顯高于活血組和補腎組(P<0.05),活血組高于補腎組(P<0.05)。各組于妊娠第5天表達(dá)量均較妊娠第6天強。見表2-3、圖2。

    表2 各組小鼠妊娠第5天著床部位子宮內(nèi)膜HB-EGF mRNA及EGFR蛋白表達(dá)的比較

    2.4 各組小鼠妊娠第5天、第6天子宮內(nèi)膜EGFR蛋白表達(dá)

    正常組腺體致密,腺上皮細(xì)胞核中EGFR表達(dá)豐富,子宮內(nèi)膜細(xì)胞質(zhì)中也有大量表達(dá);模型組腺體稀疏,腺上皮細(xì)胞核中EGFR表達(dá)較少,部分缺失,內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中幾乎無表達(dá),模型組EGFR表達(dá)較之正常組均顯著減少(P<0.01);中藥各組腺體和間質(zhì)中EGFR表達(dá)量均高于模型組(P<0.01);其中補腎活血組高于活血組(P<0.05,P<0.01),活血組高于補腎組(P<0.05,P<0.01)。見表2-3、圖3。

    圖2 各組妊娠小鼠子宮內(nèi)膜HB-EGF mRNA的PCR電泳圖

    表3 各組小鼠妊娠第6天著床部位子宮內(nèi)膜HB-EGF mRNA及EGFR蛋白表達(dá)的比較

    圖3 各組小鼠子宮內(nèi)膜EGFR蛋白表達(dá)(SP染色,×200)

    3 討論

    IVF控制性超排卵階段,必須使用大量的外源性促性腺激素促發(fā)卵巢功能,以提高獲卵率,但大量激素的應(yīng)用使得子宮內(nèi)膜容受性降低,胚胎的發(fā)育與子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步,且目前尚無理想的藥物改善子宮內(nèi)膜環(huán)境,胚泡著床率不高[3],這是生殖醫(yī)學(xué)亟待解決的問題,以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)的復(fù)方則成為目前的治療選擇之一。補腎安胎方應(yīng)用于接受輔助生殖技術(shù)的患者,有提高臨床妊娠率的作用。補腎方由菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷組成。補腎中藥有類促性腺激素樣作用,能夠增強下丘腦-垂體-性腺軸的功能[4]。其中菟絲子可使果蠅交配率明顯增加[5];桑寄生作為細(xì)胞分裂的免疫刺激劑,能夠明顯加快細(xì)胞增殖分化和組織更新[6];川續(xù)斷生物堿具有抗流產(chǎn)作用[7]?;钛接牲S芪、當(dāng)歸、丹參組成,其中黃芪具有類雌激素樣作用,可延長小鼠的動情期,對小鼠的發(fā)育有良好的影響[7];當(dāng)歸揮發(fā)油成分有抑制血小板聚集的作用,可以提高血管通透性及降低血管阻力[8];丹參有效成分可抑制血小板的聚集,防止其活性物質(zhì)釋放,避免血管收縮和血栓形成;兩者均可增加器官的血流量,改善子宮血管灌注[9-10]。

    HB-EGF是表皮生長因子家族中的多效因子之一,它與其受體相結(jié)合,調(diào)節(jié)胚胎著床的全過程和原始胚胎的分化,HB-EGF誘導(dǎo)胚胎滋養(yǎng)層表面ErbB的二聚體作用和自身磷酸化,激活絲裂原活化蛋白激酶路徑完成胚泡與內(nèi)膜的融合[11]。在圍著床期,HBEGF表達(dá)量逐漸增加,妊娠第5天~第6天達(dá)最高峰[12],故HB-EGF的表達(dá)與胚泡著床同步。用間接免疫熒光法觀察到HB-EGF在卵裂后2細(xì)胞期至10細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞表面均有大量表達(dá)[13],發(fā)揮著有絲分裂原的作用,促進(jìn)著胚泡發(fā)育和分化。故HB-EGF是衡量胚胎著床和發(fā)育狀態(tài)的關(guān)鍵因子。

    在本實驗中,我們運用PMSG聯(lián)合HCG建立控制性超排卵小鼠模型,旨在研究控制性超排卵后子宮內(nèi)膜HB-EGF及其受體EGFR表達(dá)的變化,并觀察補腎安胎方及其不同組分對表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示,正常組子宮內(nèi)膜HB-EGF基因表達(dá)高峰在妊娠第5天,而妊娠第6天即開始下降;經(jīng)外源性促性腺素刺激,模型組小鼠妊娠第5天、第6天的HB-EGF mRNA表達(dá)較正常組降低,中藥各組HB-EGF mRNA表達(dá)均較模型組明顯改善。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:EGFR蛋白表達(dá)趨勢與HB-EGF的表達(dá)變化無明顯差異,促性腺素刺激對子宮內(nèi)膜HB-EGF蛋白空間分布無影響。本實驗表明,控制性超排卵導(dǎo)致小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜HB-EGF及受體EGFR蛋白表達(dá)降低,中藥補腎安胎方能夠使子宮內(nèi)膜HB-EGF及其受體EGFR表達(dá)水平上調(diào),從而提高小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜容受性。而在拆方組中,活血組HB-EGF及其受體EGFR表達(dá)較補腎組升高明顯,全方組較之拆方組的作用明顯提高。以上結(jié)果表明,活血中藥在提高子宮內(nèi)膜容受性和促進(jìn)胚泡發(fā)育方面有積極作用,與補腎組聯(lián)合應(yīng)用效果更加明顯。

    本研究通過比較補腎安胎方及其拆方對控制性超排卵小鼠著床干預(yù)的臨床療效及相關(guān)分子水平變化,進(jìn)一步證實了補腎、活血中藥均可以提高子宮內(nèi)膜容受性,促進(jìn)胚泡生長發(fā)育。補腎、活血中藥具有選擇及協(xié)同效應(yīng),兩者聯(lián)合應(yīng)用療效更為明顯,對HB-EGF基因及其受體表達(dá)的調(diào)控可能是兩者的共同作用結(jié)果。

    [1] 張明敏,何新芳,張錦金.超排卵對小鼠著床期白血病抑制因子的影響及中藥的調(diào)節(jié)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2009,1(1):9-12.

    [2] 張明敏,張錦金,何新芳.超排卵對小鼠著床期雌,孕激素及其受體的影響及中藥調(diào)節(jié)[J].中國婦幼保健,2009,15(3):50-53.

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    [5] 吳春艷,劉峰,張雪玲.菟絲子的現(xiàn)代研究[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(14):243-244.

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