原生質(zhì)體融合技術(shù)提高微生物絮凝劑處理含油廢水效果的研究

絮凝法是處理含油廢水的一種常用方法，在廢水處理中占有十分重要的地位[1]。絮凝劑按其來源及性質(zhì)可分為無機(jī)絮凝劑、有機(jī)高分子絮凝劑和微生物絮凝劑[2]，其中微生物絮凝劑具有高效、安全無毒、無二次污染、易于生物降解等特點(diǎn)[3]。開發(fā)高效微生物絮凝劑，既能明顯提高絮凝效果，還可以大大降低絮凝劑投入量，從而降低處理成本[4]。

原生質(zhì)體融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類微生物遺傳育種[5，6]，主要包括：原生質(zhì)體的制備與再生、親本的遺傳標(biāo)記、原生質(zhì)體融合及融合重組體的檢出與分離[7]。

作者在此將絮凝劑產(chǎn)生菌與一株石油降解菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合構(gòu)建高效產(chǎn)絮凝劑的細(xì)胞工程菌，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，將其用于含油廢水處理，對其絮凝活性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B-6-1和石油降解菌SJ-1，自行保存。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g)：蔗糖 20， 尿素 0.75，酵母膏0.75，磷酸氫二鉀5， 磷酸二氫鉀5,氯化鈉0.1，去離子水1000 mL， pH值7.0。

1.2 試劑與儀器

SMM溶液(mol·L-1)：蔗糖0.5，順丁烯二酸0.02，MgCl2·6H2O 0.02，pH 值6.5。

除酵母膏為生化試劑外，其余試劑均為分析純。

TS-100型相差顯微鏡，日本尼康公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司；OIL510型全自動紅外分光測油儀，北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司；HH-6型化學(xué)耗氧量測定儀，江蘇江分電分析儀器有限公司；DBJ-623型電子變速攪拌機(jī)，解放軍四三三二工廠；PH510型臺式酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 含油廢水的配制

在1000 mL自來水中加入0.15 g硫酸亞鐵、0.1 g硝酸鈉、0.05 g硫酸鎂、 0.1 g氯化銨、0.2 g煤灰塵、0.08 g原油，pH值自然。

1.4 原生質(zhì)體的制備和再生

將微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B-6-1和石油降解菌SJ-1培養(yǎng)至對數(shù)中期，移取5 mL菌液，6000 r·min-1離心10 min，棄上清。用SMM溶液洗滌菌體2次,6000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀懸浮于10 mL SMM溶液中，充分振蕩打散菌體。移取菌懸液到離心管中，加入溶菌酶酶解，并不時(shí)振蕩。當(dāng)大部分菌體形態(tài)為球形時(shí)，停止酶解。取酶解過的原生質(zhì)體液，6000 r·min-1離心10 min，棄上清，再用SMM溶液洗滌2次，將沉淀懸浮，充分振蕩打散，4℃下保存，備用。

1.5 原生質(zhì)體的融合及篩選

60℃恒溫水浴處理微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B-6-1 70 min，于15 W紫外燈下處理石油降解菌SJ-1 20 min。取滅活后的兩親本原生質(zhì)體懸浮液各0.5 mL混勻，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入1 mL 40% PEG6000，37℃下處理15 min，立即用SMM溶液稀釋，離心棄上清，再用SMM溶液定容至1 mL，混勻后，涂SMM再生平板，37℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。

融合子接入到發(fā)酵培養(yǎng)基和原油平板中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察發(fā)酵液的粘稠度和原油平板中菌株生長情況。對發(fā)酵液粘稠且在原油平板上能夠生長的菌株進(jìn)行復(fù)篩。取初篩菌株發(fā)酵液，對某煉廠含油廢水做絮凝實(shí)驗(yàn)，測定COD和石油類去除率，將絮凝效果最好的融合菌株進(jìn)行保藏。

1.6 菌體生物量的測定

取3 mL培養(yǎng)液，6000 r·min-1離心3 min，用0.01 mol·L-1的磷酸緩沖溶液(pH值7.0)將細(xì)胞清洗3次，最后用3 mL無菌水懸浮，以無菌水為空白對照，在600 nm下測定吸光度(OD600)。

根據(jù)走訪調(diào)研，選取5種當(dāng)?shù)鼐哂写硇缘霓r(nóng)林復(fù)合經(jīng)營模式進(jìn)行深入分析評價(jià)，分別是楊樹—土雞復(fù)合經(jīng)營模式(林禽復(fù)合經(jīng)營模式)、楊樹—包菜—南瓜復(fù)合經(jīng)營模式(林菜復(fù)合經(jīng)營模式)、楊樹—麥冬復(fù)合經(jīng)營模式(林藥復(fù)合經(jīng)營模式)、楊樹—油菜復(fù)合經(jīng)營模式(林油復(fù)合經(jīng)營模式)以及純林種植模式，分別用X1，X2，X3，X4，X5表示。采取農(nóng)林復(fù)合經(jīng)營的楊樹人工林均為2013年3月造林，造林株行距均為5 m×6 m。

1.7 含油廢水絮凝處理

在250 mL燒杯中加入含油廢水150 mL，再加入適量微生物絮凝劑，在電子變速攪拌機(jī)上進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)。操作程序?yàn)椋?00 r·min-1攪拌3 min，60 r·min-1攪拌3 min，靜置3 min。取上層水樣50 mL，分別測定絮凝前后的COD和石油類濃度等[8，9]。以不加發(fā)酵液為空白對照計(jì)算去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 原生質(zhì)體融合菌株篩選結(jié)果

從發(fā)酵培養(yǎng)基上挑取了67株融合菌株，經(jīng)過初篩，選擇7株融合菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見圖1。

圖1 融合菌株篩選結(jié)果

由圖1可知，1#融合菌株的絮凝性能最好，COD去除率、石油類去除率分別達(dá)到39.5%、68.8%。將該菌株命名為FB-1，對其進(jìn)行發(fā)酵條件及絮凝條件優(yōu)化，并與融合前的菌株進(jìn)行絮凝性能比較。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種融合菌株FB-1，接種量為1%，于35℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)及生物量測定，計(jì)算COD與石油類去除率，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對微生物絮凝劑性能的影響

由圖2 可知，在接種融合菌株24 h后，菌株生長進(jìn)入對數(shù)期，32 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，44 h后進(jìn)入衰亡期。由COD與石油類去除率曲線可以看出，菌株生長穩(wěn)定后期絮凝效果最好。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間均選擇44 h。

接種量影響細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長基數(shù)以及對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，適宜的接種量會使細(xì)菌達(dá)到最佳生長狀態(tài)。接種量對融合菌株所產(chǎn)絮凝劑性能的影響結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對微生物絮凝劑性能的影響

由圖3可知，隨著接種量的增大，微生物絮凝劑的絮凝性能提高；當(dāng)接種量為1.5%時(shí)，絮凝性能最好；繼續(xù)增大接種量，絮凝性能逐漸降低。綜合考慮，選擇融合菌株FB-1的最佳接種量為1.5%。

2.2.3 初始pH值的影響

固定菌株FB-1接種量為1.5%、發(fā)酵時(shí)間44 h，其它條件不變，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值對融合菌株所產(chǎn)絮凝劑性能的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 初始pH值對微生物絮凝劑性能的影響

由圖4可知，初始pH值為7.0～8.0時(shí)，微生物絮凝劑的絮凝性能較好；pH值為8.0時(shí)，絮凝性能最佳。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳初始pH值為8.0。

2.2.4 裝液量的影響

裝液量會影響細(xì)菌生長過程中的通氣量及營養(yǎng)物質(zhì)濃度等，影響細(xì)菌的生長狀態(tài)，從而影響其產(chǎn)生的微生物絮凝劑的性能。

在250 mL錐形瓶中分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL，固定菌株FB-1接種量為1.5%、初始pH值為8.0、發(fā)酵時(shí)間44 h，其它條件不變,考察裝液量對融合菌株所產(chǎn)絮凝劑性能的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 培養(yǎng)基裝液量對微生物絮凝劑性能的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)基裝液量的增加，微生物絮凝劑的絮凝性能逐漸提高；當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)，絮凝性能最好；繼續(xù)增加裝液量，絮凝性能降低。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶。

2.2.5 培養(yǎng)溫度的影響

培養(yǎng)溫度影響細(xì)菌的生長代謝，從而對微生物絮凝劑的性能產(chǎn)生影響。溫度過低菌體生長速度變慢，溫度過高細(xì)胞內(nèi)代謝途徑將發(fā)生改變。固定菌株FB-1接種量為1.5%、初始pH值為8.0、裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶、發(fā)酵時(shí)間44 h，其它條件不變，考察培養(yǎng)溫度對融合菌株所產(chǎn)絮凝劑性能的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)溫度對微生物絮凝劑性能的影響

由圖6可知，30℃時(shí),微生物絮凝劑的絮凝性能最佳；溫度過高或過低，都會降低絮凝劑的性能。因此，選擇最佳培養(yǎng)溫度為30°C。

2.3 遺傳穩(wěn)定性及絮凝性能研究

固定菌株接種量為1.5%、初始pH值為8.0、裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶、培養(yǎng)溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間44 h，其它條件不變，比較三代融合菌株及原始菌株所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝性能，結(jié)果見圖7。

1#、2#、3#、4#分別為FB-1Ⅰ代、Ⅱ代、Ⅲ代及原始菌株B-6-1

由圖7可知，三代融合菌株FB-1所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝性能基本保持穩(wěn)定；與原始菌株B-6-1相比，COD和石油類去除率均有所提高，其中，F(xiàn)B-1Ⅲ代的石油類和COD的去除率分別為70.8%、41.2%。這表明原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠有效改善微生物絮凝劑的性能。

3 結(jié)論

篩選獲得7株融合菌株，其中，F(xiàn)B-1融合菌株所產(chǎn)絮凝劑對含油廢水的COD去除率、石油類去除率均最高，分別達(dá)到39.5%、68.8%，其絮凝性能最好；確定 FB-1的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間44 h、接種量1.5%、培養(yǎng)基初始pH值8.0、培養(yǎng)基裝液量30 mL/250 mL錐形瓶、培養(yǎng)溫度30℃；FB-1所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝性能比較穩(wěn)定，F(xiàn)B-1Ⅲ代的石油類和COD的去除率分別為70.8%、41.2%，與原始菌株B-6-1相比均有所提高，表明原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠有效改善微生物絮凝劑的性能。

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