肝細胞生長因子基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞促進大鼠肢體血管新生

劉滋康 具星愛 靳繼德 秦宜德 郭子寬

·論著·

肝細胞生長因子基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞促進大鼠肢體血管新生

劉滋康 具星愛 靳繼德 秦宜德 郭子寬

目的評價肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSC）體內(nèi)促血管新生效應(yīng)，探討其作用機制。方法結(jié)扎Wistar大鼠右側(cè)股動脈，建立局部肢體缺血模型。將hMSC、hMSC/Ad-HGF或PBS，通過肌肉注射接種于缺血區(qū)，21 d后以對側(cè)肢體為正常對照，進行激光多普勒灌注成像測定、HE染色和免疫組化檢查，評價骨骼肌微血管密度。以MTT、Transwell及內(nèi)皮細胞體外管狀結(jié)構(gòu)形成實驗，評價hMSC/Ad-HGF對血管內(nèi)皮細胞的體外增殖、遷移及成管狀能力的影響。結(jié)果21 d后，hMSC/Ad-HGF和hMSC組血流灌注水平明顯高于對照組（P＜0.01），前者接近PBS組，顯著高于hMSC組（P＜0.05）。組織學分析表明，每高倍視野肌肉組織中，hMSC/Ad-HGF組微血管數(shù)量最高，PBS組和hMSC組次之，對照組最低（P＜0.01）。hMSC/Ad-HGF培養(yǎng)上清可明顯促進ECV304細胞的增殖，刺激作用高于表皮生長因子（20 ng/mL，P＜0.001）；促進細胞跨膜遷移和管狀樣結(jié)構(gòu)形成，強于表皮生長因子。結(jié)論hMSC/Ad-HGF可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及血管結(jié)構(gòu)重建，從而引發(fā)血管新生效應(yīng)。

間充質(zhì)干細胞肝細胞生長因子血管新生基因轉(zhuǎn)移

隨著人口老齡化以及糖尿病患者的增多，心腦血管疾病的發(fā)病呈加劇態(tài)勢，因而外周動脈疾病及局部肢體缺血性疾病的研究越來越受到重視。骨髓源間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）作為一種成體干細胞，具有成骨、成軟骨、成脂肪等的分化能力，且本身分泌多種造血相關(guān)細胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)功能。因此，hMSC也可能是治療缺血性疾病的理想細胞。近年來，已經(jīng)有MSC治療骨組織損傷、移植物抗宿主病和克隆氏病等疾病的報告，并證實了MSC應(yīng)用的安全性。

然而，以往有關(guān)心肌缺血性疾病的實驗研究表明，MSC移植后大部分細胞在72 h內(nèi)死亡。在股骨頭壞死模型的研究中我們發(fā)現(xiàn)，攜帶人肝細胞生長因子的腺病毒載體感染的MSC（MSC/Ad-HGF），具有更好的抗細胞凋亡能力[1]。此外，HGF具有很強的促血管再生能力。因此，與MSC相比較，MSC/Ad-HGF可能有更好的肢體缺血治療作用。

股動脈結(jié)扎造成動物的局部肢體缺血，是目前普遍采用的動物模型[2-3]，適用于缺血性疾病發(fā)病機制及治療的基礎(chǔ)研究。本研究在制備大鼠后肢缺血模型的基礎(chǔ)上，利用激光多普勒血流灌注成像（Laser Doppler Perfusion Imaging，LDPI）技術(shù)，對大鼠后肢血流灌注水平的變化進行評估；采用標記CD31抗體的免疫組化方法，測定肌肉組織微血管密度的變化；以血管內(nèi)皮細胞ECV304細胞為對象，體外研究攜帶肝細胞生長因子基因的重組腺病毒修飾的人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSC/Ad-HGF），對其增殖、遷移及成管狀能力的影響，綜合探討HGF基因修飾后的hMSC，在局部缺血的環(huán)境下，體內(nèi)促進血管新生的功能及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心）；Ad-HGF病毒液和ECV304細胞系（本實驗室）；Matrigel（Sigma公司，美國）；激光多普勒血流灌注成像儀PeriScan PIMⅡ及LDPIwin軟件（Perimed公司，瑞典）；Transwell遷移板（Corning Costar公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局部肢體缺血模型的制備

以大鼠右后肢為手術(shù)肢，進行股動脈結(jié)扎，具體操作如下：腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，麻醉后仰臥固定，備皮，沿血管走行方向切口，暴露并分離與靜脈伴行的股動脈，結(jié)扎2次并從中間剪斷。術(shù)后48 h，取3只大鼠進行LDPI測定，評估模型制作方法。

1.2.2 缺血區(qū)注射hMSC、hMSC/Ad-HGF或PBS

常規(guī)方法擴增培養(yǎng)hMSC，制備hMSC/Ad-HGF，將第3代細胞用于實驗。

將股動脈結(jié)扎處理的大鼠分為3組，即hMSC/ Ad-HGF組、hMSC組和PBS組，每組12只。手術(shù)后24 h采用肌肉注射的方法，在缺血區(qū)進行hMSC/ Ad-HGF和hMSC的接種，每只接種量為1×106個細胞，以PBS作為對照，待第21天進行LDPI測定。

1.2.3 肢體血流灌注水平的評估

接種21 d的大鼠，8%Na2S溶液脫毛處理，利用激光多普勒血流灌注成像儀，進行LDPI測定，評估后肢血流灌注水平的變化。每個樣本測量3次，LDPIwin軟件進行分析。

1.2.4 缺血區(qū)肌肉組織微血管密度的測定

LDPI測定后的大鼠，取股四頭肌，制作石蠟切片，行HE染色，油鏡下觀察，每樣本隨機選取8個視野，以不超過8個紅細胞直徑大小的管腔結(jié)構(gòu)作為微血管，進行計數(shù)并拍照[4]，測定微血管密度。

標記CD31抗體[5]：肌肉組織切片脫蠟水化后，經(jīng)抗原修復及去除內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉4 h，rabbit anti-CD31 antibody（1∶50）4℃孵育過夜，分別以goat anti rabbit IgG-HRP（1∶500）和goat anti rabbit IgG-FITC（1∶100）37℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下或DAB顯色后觀察結(jié)果。

1.2.5 hMSC/Ad-HGF對血管內(nèi)皮細胞ECV304增殖的影響

利用MTT法，測定hMSC/Ad-HGF和hMSCs的無血清培養(yǎng)上清對血管內(nèi)皮細胞ECV304體外增殖的影響。設(shè)定5組增殖誘導體系，即①hMSC/Ad-HGF無血清培養(yǎng)上清組；②hMSC無血清培養(yǎng)上清組；③DMEM組；④DMEM+10%FBS組；⑤DMEM+ EGF（20 ng/mL）。將ECV304以每孔2 000個細胞，接種于96孔板中，12 h后取12孔行MTT法測定，讀取波長490 nm處的吸光值，，其余換成以上5種培養(yǎng)體系，每隔24 h測定1次，每組測定12孔，并將剩余細胞進行換液，連續(xù)測定3 d，結(jié)果以t檢驗法進行統(tǒng)計學分析。

1.2.6 hMSC/Ad-HGF對ECV304遷移的影響

設(shè)定5組遷移誘導體系（同上），其中hMSCs均為第3代細胞。向Transwell下室各加入600 μL遷移液，上室加入100 μL經(jīng)DMEM重懸的ECV304（1×106cells/mL），每組做3復孔，37℃、5%CO2遷移8 h。4%多聚甲醛固定10 min，Giemsa染色2 min，棉簽輕輕拭去上層細胞，光鏡下觀察結(jié)果。200倍放大后，選取細胞密度最高的5個視野計數(shù)，統(tǒng)計分析。

1.2.7 hMSC/Ad-HGF對ECV304體外成管狀能力的影響

設(shè)定2大組，A組（Matrigel包被）和B組（無Matrigel包被），每組分別設(shè)定5小組，培養(yǎng)體系同上，具體操作如下：取Matrigel冰上融化，向24孔板中每孔加入25 μL原液，37℃孵育1 h。DMEM重懸ECV304至1×106cells/mL，每孔加入4×104個細胞，每小組設(shè)3復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，Giemsa染色2 min，光鏡下觀察拍照。100倍放大倍數(shù)下，選取管狀密度最高的5個視野計數(shù)，統(tǒng)計學分析。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，以t檢驗進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠局部肢體缺血模型的建立

通過結(jié)扎右后肢股動脈制備大鼠局部肢體缺血模型，術(shù)后48 h行LDPI測定，評估血流灌注水平，檢驗?zāi)Ｐ椭苽湫Ч▓D1）。術(shù)后實驗側(cè)與正常對照側(cè)的平均值分別為1.0和1.8，實驗側(cè)血流灌注水平降低了44%，說明股動脈結(jié)扎的方法是有效的。

圖1 大鼠局部肢體缺血模型的建立及評估

2.2 接種細胞21 d后肢體血流灌注水平的評估

術(shù)后大鼠分別接種hMSC和hMSC/Ad-HGF，并以PBS作為對照組。21 d后進行LDPI測定，經(jīng)LDPIwin軟件分析獲得血液灌流量值的相對值，并進行統(tǒng)計學分析。各組經(jīng)LDPI測定時，獲得的二維彩色灌注圖像，顏色越鮮艷代表灌流量越大，顏色越暗代表灌流量越小。hMSC和hMSC/Ad-HGF組血流灌注的恢復水平要明顯高于PBS組，hMSC/Ad-HGF組恢復得最好（圖2）。為了更準確地對各組灌注水平進行評估，我們利用t檢驗的方法進行顯著性分析。LDPI測得PBS組、hMSC組、hMSC/Ad-HGF組和正常對照組的灌流相對值分別為1.46±0.12、1.74±0.13、2.03±0.16和2.05±0.14。其中，hMSC明顯高于PBS組（P＜0.01），低于hMSC/Ad-HGF組（P＜0.05）；hMSC/Ad-HGF組與正常對照組很接近，無顯著性差異。說明HGF基因修飾后的hMSC，可以更好地促進大鼠局部肢體缺血后血流灌注的恢復，具有更強的促血管新生的作用。

圖2 通過LDPI測定，評估細胞接種21 d后的血流灌注水平

2.3 缺血區(qū)肌肉組織微血管密度的檢測

接種細胞21 d后，油鏡下觀察骨骼肌微血管，以不超過8個紅細胞直徑的管腔結(jié)構(gòu)，作為微血管進行計數(shù)，其中以含有0～2個紅細胞的管腔結(jié)構(gòu)最為常見。PBS組、hMSC組、hMSC/Ad-HGF組及正常對照組的計數(shù)結(jié)果分別為6.0±1.3、8.6±1.6、14.0±1.9和8.8±1.7（圖3）。以血管計數(shù)評估微血管的密度得出，hMSC組的MVD顯著高于PBS組（P＜0.01），正常對照組低于hMSC/Ad-HGF組（P＜0.05），而略高于hMSC組，無顯著性差異，說明hMSC/Ad-HGF接種21 d后產(chǎn)生了更強的促血管新生效應(yīng)。利用免疫組化和免疫熒光的方法，以CD31抗體標記微血管，進行各組MVD的差異比較，結(jié)果與上述一致。

圖3 細胞接種21 d后，骨骼肌MVD的檢測及統(tǒng)計學分析

2.4 hMSC/Ad-HGF促進ECV304體外增殖

以MTT法檢測hMSC/Ad-HGF對ECV304體外增殖的影響。當ECV304在5種不同體系中培養(yǎng)至第2、3天時，MTT測定結(jié)果經(jīng)t檢驗分析得出，hMSC/Ad-HGF組的OD490值均高于其余各組（圖4），且差異顯著（P＜0.001），說明hMSC/Ad-HGF能有效促進血管內(nèi)皮細胞的體外增殖。

圖4 hMSC/Ad-HGF促進ECV304體外增殖（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.5 hMSC/Ad-HGF促進ECV304體外遷移

采用Transwell遷移方法，體外評價hMSC/Ad-HGF對ECV304遷移的影響。ECV304在不同的誘導體系中，遷移至Transwell膜的背面，光鏡200倍下對遷移至膜背面的細胞進行計數(shù)，DMEM、DMEM+10%FBS、DMEM+EGF、hMSC和hMSC/Ad-HGF組的計數(shù)結(jié)果分別為49±13、673±51、556±31、274±23和641±40，各組間均具有顯著性差異，而hMSC/Ad-HGF組明顯高于hMSC和DMEM對照組，說明hMSC/Ad-HGF可以體外促進ECV304遷移（圖5）。

圖5 hMSC/Ad-HGF促進ECV304體外遷移

2.6 hMSC/Ad-HGF促進ECV304體外成管狀

通過不同的處理因素對血管內(nèi)皮細胞體外成管狀能力影響的測定，進一步研究hMSC/Ad-HGF體內(nèi)促血管新生的機制。ECV304經(jīng)不同體系誘導后的體外成管狀樣結(jié)構(gòu)，以沒有包被Matrigel的DMEM+10%FBS體系進行誘導培養(yǎng)，12 h后未發(fā)現(xiàn)成管狀樣結(jié)構(gòu)，細胞生長狀態(tài)良好；包被Matrigel后僅以DMEM進行ECV304的培養(yǎng)，12 h后不僅未出現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)，貼壁細胞少且狀態(tài)較差；在相應(yīng)的誘導體系下培養(yǎng)12 h后，形成了不同程度的管狀樣結(jié)構(gòu)，DMEM+EGF+Matrigel組促進ECV304體外成管狀能力，高于DMEM+10%FBS+Matrigel組（P＜0.05），而低于hMSC+Matrigel組（P＜0.01），其中hMSC/Ad-HGF+Matrigel組成管狀能力最強，且顯著高于hMSC+Matrigel組（P＜0.001），說明hMSC/Ad-HGF具有很強的促進血管內(nèi)皮細胞體外成管狀的能力，再次證明經(jīng)HGF基因修飾的hMSC具有促進血管新生的功能（圖6）。

圖6 hMSC/Ad-HGF誘導ECV304體外成管狀

3 討論

Kinnaird等[2]證實，體外培養(yǎng)的MSC可分泌VEGF、FGF，促進內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的增殖、遷移，呈劑量依賴性；體內(nèi)以經(jīng)股動脈結(jié)扎造成單側(cè)肢體缺血的BALB/c小鼠為實驗?zāi)Ｐ停ㄟ^多點肌肉注射MSC的方法，揭示MSC通過旁分泌途徑增加缺血部位血流供應(yīng)，促進血管重建。Layman等[3]通過建立小鼠肢體缺血模型，以FGF-2和G-CSF聯(lián)合用藥的方式，闡明其促進血流供應(yīng)的恢復和成熟血管的形成，且比單一因子用藥時產(chǎn)生更強的效應(yīng)，這也說明在缺血性疾病的恢復過程中，相關(guān)細胞因子起到了重要作用。

作為一種低免疫原性細胞，MSC具有免疫抑制作用，異體細胞已經(jīng)應(yīng)用于臨床試驗，治療異基因骨髓移植后移植物抗宿主病[8-10]。因此，異體MSC聯(lián)合細胞因子治療組織缺血性疾病，可能具有更重要的潛在價值。

本實驗在建立大鼠局部肢體缺血模型的基礎(chǔ)上，通過肌肉注射經(jīng)HGF基因修飾的人骨髓MSC，并以hMSC和PBS為對照，評價hMSC/Ad-HGF異基因治療大鼠缺血，促進血管新生的功能。大鼠缺血區(qū)骨骼肌橫向切片經(jīng)HE染色，未見明顯的肌肉壞死和炎癥反應(yīng)。通過LDPI及肌肉組織MVD的測定，證實hMSC/Ad-HGF對缺血區(qū)血流灌注恢復及組織微血管密度增高均起到了良好的促進作用，且治療效果要明顯好于hMSC和PBS組，具有顯著差異性。為了深入探討hMSC/Ad-HGF體內(nèi)促血管新生的作用機制，我們以血管內(nèi)皮細胞ECV304為評價對象[6-7]，從hMSC/Ad-HGF對ECV304體外增殖、遷移以及成管狀結(jié)構(gòu)的影響等方面開展了一系列體外實驗研究。結(jié)果表明，hMSC/Ad-HGF在各處理組中，對ECV304具有最強的促進其增殖和成管狀結(jié)構(gòu)的效應(yīng)，并具有較強的誘導其遷移的能力。因此，我們推測，hMSC/Ad-HGF通過增加自身分泌的促血管生長因子，顯著促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及血管結(jié)構(gòu)的重建，并以此在體內(nèi)發(fā)揮促血管新生的作用。

[1]宮恩年,樓曉,商豐元,等.肝細胞生長因子基因修飾的間充質(zhì)干細胞治療兔股骨頭壞死[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(3): 121-124.

[2]Kinnaird T,Stabile E,Burnett MS,et al.Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms[J].Circ Res,2004,94:678-685.

[3]Layman H,Sacasa M,Murphy AE,et al.Co-delivery of EGF-2 and G-CSF from gelatin-based hydrogels as angiogenic therapy in a murine critical limb ischemic model[J].Acta Biomater,2009, 5(1):230-239.

[4]阮洪軍,陶厚權(quán),趙仲生.胃癌組織中微血管密度的測定及其臨床意義[J].腫瘤學雜志,2008,14(6):443-445.

[5]Casneuf VF,Demetter P,Boterberg T,et al.Antiangiogenic versus cytotoxic therapeutic approaches in a mouse of pancreatic cancer: an experimental study with a multitarget tyrosine kinase inhibitor (sunitinib),gemcitabine and radiotherapy[J].Oncol Rep,2009,22 (1):105-113.

[6]Zheng ZZ,Liu ZX.CD151 gene delivery increase eNOS activity and induces ECV304 migration,proliferation and tube formation [J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(1):66-72.

[7]Wang SB,Cheng YN,Cui SX,et al.Des-gamma-carboxy prothrombin stimulates human vascular endothelia cell growth and migration[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(5):469-477.

[8]王恒湘,邊素燕,陳金龍,等.間充質(zhì)干細胞不抑制體內(nèi)T淋巴細胞的增殖[J].組織工程與重建外科雜志,2005,1(5):248-250.

[9]王恒湘,郭子寬.間充質(zhì)干細胞在組織再生應(yīng)用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(5):241-245.

[10]Riekstina U,Cakstina I,Parfejevs V,et al.Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow,adipose tissue,heat and dermis[J].Stem Cell Rev and Rep,2009,5(4):378-386.

Human Mesenchymal Stem Cells Modified by Hepatocyte Growth Factor Gene Promote Angiogenesis of Local Limb Ischemia in Rats

LIU Zikang1,JU Xingai2,Jin Jide2,QIN Yide1,GUO Zikuan2.
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology,Anhui Medical University,Hefei 230032,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding authors:QIN Yide,GUO Zikuan.

ObjectiveTo evaluate the angiogenesis-promoting activities of human mesenchymal stem cells(hMSCs) modified by hepatocyte growth factor(HGF)in vivo and further investigate the underlying mechanisms.MethodsWistar rat limb ischemia model was developed by ligation of the right femoral artery.hMSC were infected by an adenoviral vector carrying human HGF cDNA.Aliquots of hMSC/Ad-HGF,hMSC or PBS were injected intramuscularly into the ischemic area of a rat limb ischemia model and 21 days later,laser Doppler perfusion imaging was performed to detect the blood flow of the limbs.Microvessel density(MVD)was evaluated by HE staining and immunohistochemistry on skeletal muscle sections.Evaluation of proliferation,migration and forming tube-like structures on ECV304 cells impacted by hMSC/Ad-HGF was determined by MTT,Transwell migration and tubercular structure formation assays.ResultsIn contrast to PBS,injection of hMSC/Ad-HGF and hMSC significantly improved the blood flow perfusion of the ischemic limbs.The relative means of the blood perfusion in hMSC/Ad-HGF-treated rats were comparable to those of the left legs and greater than those of hMSC-transplanted legs(P＜0.05).The amounts of micro-vessels per high-fold field were highest in the hMSC/Ad-HGF-treated muscles,followed by those of PBS and hMSC,and all of them were greatly higher than those of normal controls(P＜0.01).Thesupernatants of hMSC/Ad-HGF were shown to promote the proliferation of ECV304 cells and the stimulation activity was greater than that from recombinant human epithelial growth factor at a concentration of 20 ng/mL(P＜0.001).In agreement, the conditioned medium of hMSC/Ad-HGF exhibited a greater activity than epithelial growth factor to enhance the transmembrane migration and tubercular structure formation of ECV304 cells.ConclusionHGF gene-modified human mesenchymal stem cells promote the proliferation,migration and vascular formation of endothelial cells,thus activating the angiogenesis process.

Mesenchymal stem cell;Hepatocyte growth factor;Angiogenesis;Gene transfer

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）02－0061－05

2010年1月8日；

2010年1月29日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.001

國家高科技研究發(fā)展計劃項目（863項目）（2007AA02Z454）；國家自然科學基金項目（30873018，30971068）。

230032安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室（劉滋康，秦宜德）；100850北京市軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所實驗血液學研究室（具星愛，靳繼德，郭子寬）。

秦宜德，郭子寬。