與紅外可視膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的南方鲇面葉腦片急性分離培養(yǎng)技術(shù)*

趙 磊，梁劍弦，龍?zhí)斐?/p>

(1．廣州醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣東 廣州 510282；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

腦片培養(yǎng)作為一種短時(shí)間離體移植培養(yǎng)的制備技術(shù)，兼有在體實(shí)驗(yàn)和離體培養(yǎng)的優(yōu)良特點(diǎn)，是處于細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物模型之間的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。不僅滿足體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件易于控制、實(shí)驗(yàn)過程易于觀察的要求，保持了在體神經(jīng)細(xì)胞之間及神經(jīng)細(xì)胞與非神經(jīng)細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)聯(lián)系，又具備了與體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和環(huán)境更貼近的優(yōu)勢。腦片實(shí)驗(yàn)排除了血壓、溫度、電解質(zhì)、血腦屏障等因素的干擾，僅通過改變?nèi)斯つX脊液或氣體的成分，實(shí)現(xiàn)了對(duì)標(biāo)本環(huán)境的控制。隨著腦片培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，目前國內(nèi)外建立了新生鼠和成年鼠的海馬、大腦皮質(zhì)、中腦黑質(zhì)、下丘腦[1-4]等的腦片培養(yǎng)技術(shù)，但是在魚類的腦片培養(yǎng)、味覺中樞神經(jīng)元的電學(xué)特性、信號(hào)編碼的微回路、膜片鉗方法的研究等進(jìn)展較慢[5-7]。通過組織學(xué)、神經(jīng)束路追蹤和電生理學(xué)記錄等方法的研究已知面葉作為初級(jí)中樞在魚類口外味覺中的重要作用[8-10]，并初步確立了延腦味覺初級(jí)中樞的構(gòu)筑和大致功能。魚類味覺的編碼方式和調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，目前的研究結(jié)果雖然能部分的回答魚類味覺與行為方面的問題，但對(duì)于全面了解魚類味覺的生理機(jī)制，解讀味覺信息的編碼與動(dòng)物行為遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。外周皮膚味蕾感受器不同種類及其分布、外周傳入神經(jīng)編碼機(jī)制可能減少味覺信息的冗余，但是對(duì)于關(guān)系到動(dòng)物行為的味覺信息處理，中樞神經(jīng)元的活動(dòng)更為重要。但不同文獻(xiàn)中腦片急性分離和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件(培養(yǎng)溫度、不同配方的腦脊液等)均存在各種差異[11-12]。本研究選取廣東省普遍養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類—南方鲇，分別建立各種實(shí)驗(yàn)條件，在改變時(shí)間、溫度、腦脊液配方等實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，運(yùn)用組織化學(xué)和腦片膜片鉗技術(shù)觀察腦片活性的變化，旨在探討影響魚類腦片體外培養(yǎng)的諸多因素，有助于深入研究魚類延腦面葉中樞神經(jīng)元的基本功能，多層次多方位分析魚類味覺信息編碼與味覺調(diào)控的機(jī)理，為腦片實(shí)驗(yàn)技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。建立的膜片鉗技術(shù)有利于對(duì)延腦初級(jí)味覺中樞神經(jīng)元的基本電生理特性進(jìn)行觀察，并對(duì)涉及其中的離子通道結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行深入研究，同時(shí)可以分析基本的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)其的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

半月齡南方鲇SilurusmeridionalisChen，10～20 g/尾，體長5～8 cm，雌雄不拘。購于廣東省水產(chǎn)研究所南海養(yǎng)殖基地。實(shí)驗(yàn)室24 h循環(huán)水中飼養(yǎng)。

1.2 腦脊液(ACSF)配方

標(biāo)準(zhǔn)ACSF(mmol/L)：NaCl，124；KCl，2；MgSO4，1.6；NaHCO3，24；葡萄糖，10；CaCl2，2；KH2PO4，1.25。蔗糖+ACSF：標(biāo)準(zhǔn)ACSF中，加入150 mM 蔗糖。TU+ Vc+ACSF：NaCl，124；KCl，2；MgSO4，1.6；NaHCO3，24；葡萄糖，10；CaCl2，2；KH2PO4，1.25；Vc，0.4；硫脲，0.8。HEPES+ ACSF：NaCl，124；KCl，2；MgSO4，1.6；NaHCO3，24；葡萄糖，10；CaCl2，2；KH2PO4，1.25；4-羥乙基哌嗪乙磺酸，50。HEPES+Vc+TU+ kynurenic acid +低鈣ACSF：NaCl，124；KCl，2；MgSO4，1.6；NaHCO3，24；葡萄糖，10；CaCl2，0.2；KH2PO4，1.25；Vc，0.4；硫脲，0.8；4-羥乙基哌嗪乙磺酸，50；犬尿氨酸，1。

1.3 面葉腦片的制備

于含有磺酸甲烷(MS 222：150 mg/L)的試驗(yàn)水槽中麻醉南方鲇2～3 min。迅速開顱取全腦，置于含混合氣(95%O2+5%CO2, 以體積分?jǐn)?shù)計(jì))冰凍ACSF(pH7.4)中冷卻清洗1 min，分離出延腦，4 ℃震動(dòng)切片機(jī)下制成300 μm面葉冠狀切片。腦片在3 mL ACSF中持續(xù)培養(yǎng)4 h，每組5片，互不重疊，持續(xù)通入混合氣。每次留存部分腦片于切片后立即TTC染色，若出現(xiàn)著色偏淺或明顯損傷，該批次標(biāo)本即不予采用。

1.4 TTC染色

面葉腦片放置在2% TTC+腦脊液中，避光溫浴(34 ℃)相應(yīng)時(shí)間段后，取出腦片用生理鹽水漂洗，濾紙吸去表面水分后稱濕重，以1 g/20 mL加入抽提液(乙醇∶二甲亞砜= 1∶1) ，在密閉容器內(nèi)避光放置24 h，搖勻后取100 μL至96孔板，在波長490 nm下，用酶標(biāo)儀測定各孔光密度(A490值) 。只通混合氣( 95% O2+5% CO2，以體積分?jǐn)?shù)計(jì))的腦片測得A490值作為正常對(duì)照用來計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組腦片TTC染色下降百分率。

腦片TTC染色下降率(組織損傷率) =(1-A490損傷/A490對(duì)照) ×100 %

1.5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)面葉腦片活力的影響

將面葉腦片別放入3 mL不同配方ACSF中培養(yǎng)。分別于 5，10，15，30，60，120，180，240 min培養(yǎng)時(shí)間取出樣本TTC染色，計(jì)算組織損傷率 (%)。同時(shí)紅外倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)后制成7 μm石蠟切片，Nissl染色。

1.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)面葉腦片活力的影響

將面葉腦片分別置于3 mL不同溫度(18，22，25，30 ℃)不同配方ACSF中孵育3 h，溫度浮動(dòng)范圍保持在0.15 ℃ 之內(nèi)，隨后 TTC染色，計(jì)算組織損傷率(% )。同時(shí)紅外倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)后制成7 μm石蠟切片，Nissl染色。

1.7 面葉腦片電生理特性檢測

選取25 ℃，30 min，HEPES+Vc++TU+ kynurenic acid +低鈣腦脊液中培養(yǎng)的腦片，恒流泵持續(xù)向腦片浴槽灌注含95%O2+5%CO2(以體積分?jǐn)?shù)計(jì))的ACSF，流速為 1～2 mL/min，腦片浸沒于液面下1～2 mm，室溫25 ℃。拉制好的電極尖端直徑約1～2 μm，充灌電極內(nèi)液后阻抗為 2～5 MΩ。內(nèi)液成分(mM) : KCl，140；CaCl2，1；MgCl2，2；EGTA，11；HEPES，10；ATP，2(pH 7.2)。所有電刺激均在胞體內(nèi)給予。數(shù)據(jù)采集、記錄和分析采用Axon laboratory 提供的軟件包Clampex9.0進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 不同配方腦脊液對(duì)面葉腦片活力的影響

與同一時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)ACSF培養(yǎng)的腦片相比，蔗糖+ACSF，TU+ Vc+ACSF，HEPES+ACSF和HEPES+Vc++TU+kynurenic acid +低鈣ACSF培養(yǎng)液均不同程度的抑制腦片A490nm值的降低，而各組腦片形態(tài)有顯著差異 (圖1)。結(jié)果表明，HEPES+Vc++TU+kynurenic acid +低鈣ACSF培養(yǎng)的腦片中神經(jīng)元細(xì)胞明顯且緊密排列，膜完整而光滑，形態(tài)正常有突起，胞體成圓形、橢圓形和梨形，維持存活時(shí)間長。

圖1 30 min，25 ℃不同培養(yǎng)液中的南方鲇面葉腦片

(上圖為紅外可視顯微鏡下的觀察;下圖為nissl染色圖片。標(biāo)尺為100 μm; A:HEPES+Vc++TU+kynurenic acid +低鈣ACSF; B: HEPES+ACSF; C: TU+ Vc+ACSF; D: 蔗糖+ACSF; E: 標(biāo)準(zhǔn)ACSF)

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)面葉腦片活力的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，面葉腦片TTC染色A490 nm值逐漸下降。2 h后損傷率均較顯著，標(biāo)準(zhǔn)ACSF，蔗糖+ACSF，TU+ Vc+ACSF，HEPES+ACSF，和HEPES+Vc++TU+kynurenic acid +低鈣ACSF培養(yǎng)液中培養(yǎng)腦片的損傷率分別為：(61.2±5.07)%，(59.9±6.14)%，(52.9±5.23)%，(51.6±4h97)%和(50.2±4.17)%。本實(shí)驗(yàn)隨后進(jìn)行的電生理試驗(yàn)時(shí)間均小于2 h，損傷程度較為溫和(圖2)。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)腦片活力的影響

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)面葉腦片活力的影響

腦片在18，22及30 ℃ACSF中孵育2 h后，與25 ℃培養(yǎng)的腦組織相比，均大幅度降低腦片TTC染色A490nm值，造成不同程度的損傷。18 ℃與20 ℃下培養(yǎng)腦片損傷程度相近，無明顯區(qū)別(P>0.05) ，但與30 ℃相比，較低溫度時(shí)腦片損傷程度明顯減輕(P< 0.05)。25 ℃腦組織活力明顯比其他溫度高，且接近魚類在體腦組織溫度，試驗(yàn)結(jié)果較為可靠，可以確定為本實(shí)驗(yàn)比較理想的造模溫度 (圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)腦片活力的影響

2.4 面葉腦片的電生理學(xué)特性

在全細(xì)胞電流鉗模式下將膜電流鉗制在0 pA，使細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。根據(jù)自發(fā)放電頻率及動(dòng)作電位特征分為兩大類，分別對(duì)應(yīng)于形態(tài)學(xué)上的梨形和橢圓形神經(jīng)元。測定兩種類型神經(jīng)元的靜息電位。結(jié)果表明兩種類型神經(jīng)元的靜息電位無明顯區(qū)別(P>0.05)。橢圓形神經(jīng)元為(-68±3)mV(n= 18)，梨形神經(jīng)元為(-70±4) mV(n=25)。而前者的膜電容為(32±6 pF)(n=15)顯著大于后者的(15±4pF)(n= 20)(P< 0.05)。在記錄的細(xì)胞中未觀察到自發(fā)放電現(xiàn)象，但兩種細(xì)胞均對(duì)去極化電流刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位，橢圓形神經(jīng)元的誘發(fā)放電頻率(5±3) Hz(n= 5)小于梨形神經(jīng)元(10±5) Hz(n= 5)(P< 0.05)(圖4)。

圖4 面葉中橢圓形(A)和梨形(B)神經(jīng)元誘發(fā)放電的比較圖

3 討 論

雖然細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的制作已發(fā)展的非常成熟，可用于在體生理和病理研究，各自都不可避免地存在著一定缺陷。細(xì)胞培養(yǎng)雖具備實(shí)驗(yàn)條件易于控制，易于進(jìn)行操作，經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，但是脫離了體內(nèi)環(huán)境，使其喪失了組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞之間的聯(lián)系以及一部分與之相關(guān)的生化特性；動(dòng)物模型雖能夠得到整體病理生理反應(yīng)，但對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的操控非常受限且由于受到體內(nèi)多種因素的影響很難對(duì)單一因素進(jìn)行分析。腦片培養(yǎng)正是在細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物模型之間建立的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，保留與體內(nèi)相近的神經(jīng)發(fā)育形態(tài)及功能特征，允許對(duì)可能的調(diào)控因子進(jìn)行操作，并且結(jié)合免疫組化及生理學(xué)方法有利于更全面了解神經(jīng)發(fā)育機(jī)制。而離體培養(yǎng)的腦片包含了與在體腦組織相同的細(xì)胞種類及三維空間結(jié)構(gòu)，保存了正常完整的突觸回路、受體分布、遞質(zhì)傳遞和其他生理功能。體外培養(yǎng)48 h內(nèi)依然保持良好的活性，離子通道性質(zhì)不會(huì)發(fā)生變化。

但是離體腦片經(jīng)過組織分離和切片等過程，環(huán)境與在體時(shí)有了較大的改變。切制過程中組織損傷、缺氧等引起不同程度的病理變化，比如樹突、軸突腫脹，神經(jīng)元之間形成含水腔隙，這些變化在剛切成的腦薄片較嚴(yán)重。但這些可以通過腦片的孵育培養(yǎng)過程，基本得到恢復(fù)。ACSF不含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、激素等物質(zhì)，和天然腦脊液的成分有一定的差異。因此在腦片培養(yǎng)過程中，時(shí)間、溫度、滲透壓、酸堿度等的控制以及抗缺氧、酸化的處理尤為重要。

Nissl染色結(jié)果顯示，經(jīng)穩(wěn)定2 h后的腦片細(xì)胞有規(guī)則地緊密排列，細(xì)胞大而明顯，膜完整光滑，胞體呈橢圓型；細(xì)胞中央有一個(gè)大而圓的細(xì)胞核，核異染量少，故著色淺。個(gè)別區(qū)域有零星散在環(huán)死神經(jīng)細(xì)胞。說明孵育初期由于腦片制備過程中的機(jī)械損傷導(dǎo)致部分細(xì)胞水腫死亡，隨著孵育時(shí)間增長到2 h，損傷死亡的細(xì)胞被清除，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得更加清晰。溫度對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長有重要影響。南方鲇延腦神經(jīng)細(xì)胞在 18～28 ℃之間均能生長，但在 25 ℃時(shí)腦片的色澤最好，顏色呈深灰色，神經(jīng)纖維和胞體區(qū)的分界清楚。哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)一般是在 37 ℃，與南方鲇延腦神經(jīng)細(xì)胞最適生長溫度顯然不同。由于南方鲇常年生活在長江中下游水體環(huán)境的中下層，其外周環(huán)境溫度一般在25 ℃左右。這說明了外周環(huán)境溫度與魚類神經(jīng)細(xì)胞生長之間有密切關(guān)系。而且溫度降低，不僅能提高溶氧的分壓，同時(shí)降低代謝速度，有利于神經(jīng)元在缺葡萄糖后的恢復(fù)[11-12]。這都有利于短時(shí)間內(nèi)保持標(biāo)本的活性。

早期研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奶岣邼B透壓能有效的阻止神經(jīng)元水腫，有助細(xì)胞功能恢復(fù)。試驗(yàn)中添加蔗糖和HEPES均有提高溶液滲透壓的作用，神經(jīng)元水腫得到抑制。但隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，添加蔗糖ACSF的細(xì)胞明顯出現(xiàn)皺縮。添加HEPES沒有變化。這說明腦片神經(jīng)元水腫與局部環(huán)境pH的變化有關(guān)。NaHCO3-CO2緩沖對(duì)的緩沖能力不強(qiáng)，細(xì)胞呼吸以及死亡時(shí)內(nèi)容物的釋放，乳酸鹽的產(chǎn)生等都會(huì)造成局部pH變動(dòng)，當(dāng)pH的變化超過神經(jīng)元能承受的限度就會(huì)影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，甚至加速細(xì)胞死亡[13-14]。HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)是一種廣泛應(yīng)用的緩沖劑，其緩沖能力強(qiáng)大( pH6.8～8.2) 可以減緩孵育液中細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累所致的酸化速度同時(shí)有效穩(wěn)定細(xì)胞周圍環(huán)境pH，受外界因素影響小，不形成緩沖劑—金屬離子復(fù)合物，配合適當(dāng)?shù)母邼B效果，從而阻止神經(jīng)元水腫。

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要、腦內(nèi)含量最高的一種內(nèi)源性興奮性氨基酸，具有許多生理功能和病理生理學(xué)作用，如在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)元的損傷、 癲癇、 神經(jīng)元退行性疾病中具有重要作用。因此探討腦片培養(yǎng)過程中谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的損傷機(jī)制有重要意義，因?yàn)檫@與腦片的缺血、 缺氧等許多致死因素較為敏感[15-16]。針對(duì)內(nèi)源性谷氨基酸對(duì)神經(jīng)元的損傷，在HEPES高滲ACSF溶液中添加了谷氨酸受體的廣泛性抑制劑——犬尿氨酸KYNA 1mM。KYNA是在人類和嚙齒類動(dòng)物的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中由KAT催化KYN不可逆生成的，通過拮抗大腦N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate NMDA)受體谷氨酸鹽結(jié)合位點(diǎn)成為內(nèi)源性神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸受體的廣泛拮抗劑。它是避免興奮性氨基酸損傷腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)的有效保護(hù)因子，具有抗驚厥、抗痙攣的作用。當(dāng)濃度相對(duì)較低時(shí)，KYNA是甘氨酸受體的拮抗劑。濃度相對(duì)較高時(shí)，KYNA是NMDA及AMPA受體的拮抗劑。石蠟切片觀察統(tǒng)計(jì)，沒有添加KYNA的ACSF，腦片神經(jīng)元由于損傷細(xì)胞釋放的內(nèi)源性谷氨酸，在培養(yǎng)過程中對(duì)大部分谷氨酸敏感神經(jīng)元造成不可逆的損傷。

維生素C (Vitamin C)是一種重要的水溶性維生素及抗氧化劑，相對(duì)分子質(zhì)量較小能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接或間接清除氧自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，是天然的氧自由基清除劑。其基本功能是通過在酶系中傳遞電子，以保持離子平衡，參與氧化還原反應(yīng)，因而能對(duì)抗氧自由基的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器。已知維生素 C可促進(jìn)鼠胚神經(jīng)上皮細(xì)胞的分裂及損傷后的修復(fù)，還可使神經(jīng)上皮細(xì)胞膜上的糖蛋白維持正常水平，使細(xì)胞黏著、識(shí)別和遷移準(zhǔn)確進(jìn)行。大劑量維生素C可以清除腦組織中的自由基，減輕腦細(xì)胞損傷[17-18]。在ACSF中添加Vc以保護(hù)神經(jīng)元活性起到抗氧化的作用。由于Vc在水溶液中不穩(wěn)定，溶液中還需要加入適量的TU(硫脲)防止Vc變質(zhì)。相關(guān)的手術(shù)器具，溶液配制、盛裝器具等使用前也要經(jīng)過相關(guān)處理。

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