蘭州百合鱗片組織培養(yǎng)研究

劉雅楠,黃惠英,2,張金文

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生產(chǎn)類實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

蘭州百合(Lilium davidii var.willmottiae)是百合科百合屬川百合的變種,屬于多年生鱗莖類草本植物[1]。其鱗片味極甜美,潔白如玉、個大、營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)肥厚香甜,纖維很少,聞名全國,亦可稱世界第一,為我國食用百合最佳品種,不僅具有極高營養(yǎng)價值,還有很高的藥用價值,具養(yǎng)陰潤肺、清心安神、清熱利尿等功效。此外,蘭州百合也是蔬菜中的珍品,可烹甜食,可炒食、煮食或作清涼飲料,消暑去熱[2]。

蘭州百合在甘肅栽培歷史悠久,生產(chǎn)中長期以來主要靠無性繁殖再生產(chǎn)或擴(kuò)大種植規(guī)模。傳統(tǒng)的無性繁殖方式主要有小鱗莖分株繁殖,單鱗片扦插[3]。小鱗莖分株繁殖方式,在生產(chǎn)中應(yīng)用較廣,優(yōu)點(diǎn)在于能保持其后代遺傳基礎(chǔ)的一致性,較少發(fā)生變異。百合長期的無性繁殖會使植株逐漸積累大量病毒,發(fā)生病毒病并導(dǎo)致種性退化,造成植株生長勢衰弱,產(chǎn)量下降,品質(zhì)變差,這成為蘭州百合發(fā)展中的一大障礙,是生產(chǎn)中急待解決的問題。種子繁殖雖能獲得大量無病健康的幼苗,但百合結(jié)實(shí)率極低,且種子發(fā)芽緩慢,栽培周期長,在生產(chǎn)中不適宜大規(guī)模采用,難以滿足市場需求。為克服傳統(tǒng)繁殖方法的不足,加快繁殖速度,提高經(jīng)濟(jì)效益,組織培養(yǎng)技術(shù)無疑是一種較好的方法。有關(guān)百合組織培養(yǎng)方法在國內(nèi)外都做了不少研究,繁殖的效果也較好[4-8]。近年來,蘭州百合組織培養(yǎng)技術(shù)的研究也有報道[9,10],多以鱗片為外殖體,繁殖率高,但不同部位鱗片的繁殖效果可能存在差異。試驗(yàn)以蘭州百合內(nèi)層鱗片為試驗(yàn)材料,研究不同生長調(diào)節(jié)劑配比對組織培養(yǎng)的影響,并篩選出最佳培養(yǎng)基配方,為生產(chǎn)大量的蘭州百合脫毒苗,提高種球繁殖率、抗病性,實(shí)現(xiàn)百合優(yōu)質(zhì)母籽繁育產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持,也為蘭州百合種球產(chǎn)業(yè)化的持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

蘭州百合從蘭州西果園購得。選擇個大色白,鱗片包和緊密,獨(dú)頭或者是兩頭,肉質(zhì)肥厚的鱗莖。取內(nèi)層鱗片切成5 mm×5 mm的小塊作為外殖體。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 外殖體滅菌處理及基本培養(yǎng)條件 將蘭州百合的鱗莖撥開,分為外、中、內(nèi)3部分,洗去上面的泥土,再用洗衣粉溶液浸泡10～15 min,然后在自來水上沖洗10～15 min。在超凈工作臺上采用15%84消毒液處理15 min+0.1%升汞處理5～6 min,無菌水沖洗3次進(jìn)行外殖體消毒處理。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度組合的生長調(diào)節(jié)劑,培養(yǎng)基中均加入0.75%瓊脂,蔗糖30 g/L,pH 5.8～6.2,溫度 22～25℃;設(shè)10℃低溫處理,光照時間 12 h/d,光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx。每種培養(yǎng)基接種10瓶,每瓶2～3株。

1.2.2 初代培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度6-BA與NAA、IAA和2,4-D組合的生長調(diào)節(jié)劑配方。6-BA與NAA組合時,6-BA濃度設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L,NAA 濃度設(shè) 0.1、0.2 mg/L;另以1.5 mg/L 6-BA;0.2 mg/L 2,4-D與0.1,0.2和0.3 mg/L IAA組合。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度組合的6-BA與NAA。6-BA濃度設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L,NAA 濃度設(shè) 0.1、0.2、0.3 、0.4 、0.5 mg/L。

1.2.4 生根培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基,采用單因素試驗(yàn)設(shè)計NAA、蔗糖濃度對無菌苗生根與結(jié)鱗莖的影響。NAA 濃度設(shè) 0.1、0.2 、0.3、0.4、0.5 mg/L,蔗糖濃度為 30、40、50 、60、70 g/L。

1.3 統(tǒng)計與分析

蘭州百合鱗片外殖體培養(yǎng)30 d進(jìn)行觀察統(tǒng)計,分別計算分化率。不定芽切成單芽接種至增殖培養(yǎng)基中,待芽長約2～3 cm時,統(tǒng)計增殖率。不定芽接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d后,記錄小苗的生根和結(jié)鱗莖情況。采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

分化率=每處理組分化外殖體數(shù)/每處理組接種外殖體總數(shù)×100%

增殖率=每處理組增殖芽總數(shù)/每處理組接種不定芽總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位鱗片的培養(yǎng)

對同一鱗莖的內(nèi)、中、外3部分,滅菌后分別接種于初代培養(yǎng)基上,記錄15 d后不同部位的鱗莖滅菌效果(表1)。同一品種的鱗莖,鱗片來源不同,用同樣的滅菌方式,鱗片的污染率不同,內(nèi)層鱗片的污染率低于中層鱗片,中層鱗片的污染率低于外層鱗片。內(nèi)層鱗片成活率高于中層鱗片和外層鱗片。由此可見,內(nèi)層鱗片比中層鱗片和外層鱗片容易滅菌。主要是由于內(nèi)層鱗片被中層,外層鱗片包裹著,與外部環(huán)境基本沒有接觸,受到細(xì)菌感染和機(jī)械損傷的幾率較小,滅菌效果較好。相比之下,外層鱗片與土壤,空氣等接觸以及機(jī)械損傷,容易受到細(xì)菌的浸染。因此,外層鱗片的污染率高于內(nèi)層鱗片,而中層鱗片處于內(nèi)層鱗片和外層鱗片的中間,所以中層鱗片的污染率和成活率就介于內(nèi)層鱗片和外層鱗片。

表1 不同部位外殖體的成活率Table 1 Surviving ratio of different parts of explants

2.2 生長調(diào)節(jié)劑對初代培養(yǎng)的影響

以蘭州百合的內(nèi)層鱗片為外殖體,接種于初代培養(yǎng)基上,30 d后統(tǒng)計分化率,發(fā)現(xiàn)分化率與培養(yǎng)基有密切關(guān)系(表2)。當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時,培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA的分化率最高為92%,與添加其他濃度6-BA的培養(yǎng)基差異達(dá)極顯著水平,而添加0.5,1.5和2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基分化率差異不顯著;當(dāng)NAA濃度為 0.1 mg/L時,添加 0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基分化率明顯高于其他培養(yǎng)基;此外,添加不同濃度IAA的培養(yǎng)基中,外殖體分化率無顯著差別。當(dāng)NAA為0.2 mg/L時,隨6-BA濃度的升高,鱗片分化率呈先升后降的趨勢,6-BA濃度升至1.0 mg/L鱗片分化率最高,更高濃度的6-BA將抑制鱗片的分化,且分化出的叢芽太過密集,單芽質(zhì)量差,有的還出現(xiàn)畸形、玻璃化等現(xiàn)象;NAA濃度為0.1 mg/L,隨著6-BA濃度的升高,鱗片分化率總體呈下降趨勢。由此可見,分化率與培養(yǎng)基的生長調(diào)節(jié)劑濃度配比有著極其密切的關(guān)系,當(dāng)6-BA和NAA濃度比例為5∶1時,蘭州百合的分化率較高。

培養(yǎng)基添加到一定濃度的6-BA、2,4-D后,再附加不同濃度IAA,隨著IAA濃度的升高,外殖體分化率沒有顯著變化,且分化率均較低,不定芽生長較差,出苗時間長,分化出的試管苗出現(xiàn)畸形、玻璃化等現(xiàn)象,葉色較淺。表明2,4-D和IAA在誘導(dǎo)蘭州百合鱗片培養(yǎng)上,沒有起到促進(jìn)作用。蘭州百合以內(nèi)層鱗片為外殖體的初代培養(yǎng)過程中,最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表2 不同培養(yǎng)基對外殖體誘導(dǎo)分化的影響Table 2 Effect of medium on inducement and differentiation of callus

2.3 溫度對初代培養(yǎng)不定芽分化形成的影響

將采集的蘭州百合鱗莖,去內(nèi)層鱗片消毒滅菌后接種于添加0.2 mg/L NAA和不同濃度6-BA的初代培養(yǎng)基上,低溫處理后培養(yǎng)30 d統(tǒng)計分化率(表3)。結(jié)果表明,低溫處理后的鱗片,分化率明顯高于未經(jīng)低溫處理鱗片的20%,并且分化時間較短,生長狀態(tài)較好。說明低溫處理能夠打破休眠,利于蘭州百合鱗片的初代培養(yǎng)。

表3 低溫處理鱗片初代培養(yǎng)基篩選結(jié)果Table 3 Selection of flake initial culture under low temperature treatment

2.4 生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖培養(yǎng)的影響

將蘭州百合鱗片誘導(dǎo)分化的不定芽切成單芽接到增殖培養(yǎng)基中,待不定芽長2～3 cm時統(tǒng)計增殖率。(表4)。不同濃度的6-BA與NAA對不定芽增殖的影響不同,蘭州百合增殖培養(yǎng)基中,MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)為3.07,極顯著高于其他培養(yǎng)基。因此,蘭州百合增殖培養(yǎng)基中的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。當(dāng)6-BA濃度一定時,隨著NAA濃度的升高,可分化出質(zhì)量較好的叢芽,且叢芽生長較快,整齊,葉片也較整齊,葉色濃綠。當(dāng)NAA濃度在0.5 mg/L以下,分化出的叢芽過于密集,葉片卷曲,甚至有的出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,單芽質(zhì)量較差。當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時,芽生長比較緩慢,單芽質(zhì)量較差。

表4 不同增殖培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響Table 4 Effect of medium on shoots multiplication

2.5 不同濃度蔗糖、NAA對試管苗生根和結(jié)鱗莖的影響

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,觀察不同濃度蔗糖對不定芽形成的小苗生根和結(jié)鱗莖的影響(表5)。將無菌苗接到附加不同糖濃度的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)8～10 d,開始長根,18～20 d后葉片基部膨大,葉片頂部開始逐漸變黃枯萎,40 d后開始有鱗莖形成。另外,糖濃度對蘭州百合的生根和結(jié)鱗莖有著重要的作用,當(dāng)糖濃度達(dá)到50 g/L時,無菌苗100%結(jié)鱗莖。隨著糖濃度的提高,所結(jié)鱗莖增大,根數(shù)有所下降,當(dāng)糖濃度達(dá)到70 g/L時,鱗莖新葉不易抽出,鱗莖的色澤變暗。綜合鱗莖生長指標(biāo),以糖濃度60 g/L的生根效果較好,此濃度培養(yǎng)基上所結(jié)的鱗莖較大,鱗莖色澤濃綠,新葉多、葉片展開,小苗的根較多、根毛也較多。較適合蘭州百合生根結(jié)鱗莖的培養(yǎng)基為1/2 MS+蔗糖60 g/L。

表5 蔗糖濃度對生根結(jié)鱗莖的影響Table 5 Effects of sucrose concentration on rooting

在基本培養(yǎng)基添加60 g/L蔗糖的基礎(chǔ)上,研究不同濃度NAA對幼苗生根和結(jié)鱗莖的影響(表6)。培養(yǎng)基添加0.1,0.2 mg/L NAA結(jié)鱗莖率極顯著高于其他培養(yǎng)基,且所誘導(dǎo)的根粗極顯著高于其他培養(yǎng)基。NAA濃度對蘭州百合鱗莖分化的無菌苗生根結(jié)鱗莖影響較大。觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)濃度中,當(dāng)NAA濃度高于0.2 mg/L時,小苗的結(jié)鱗莖率都隨著NAA濃度的提高而降低,根粗也呈下降趨勢。綜合所誘導(dǎo)的根粗和結(jié)鱗莖率兩項(xiàng)指標(biāo),蘭州百合生根培養(yǎng)基中添加NAA的最適宜濃度為0.2 mg/L。蘭州百合無菌苗生根培養(yǎng)基的最佳組合為1/2 MS+0.2 mg/L NAA+60 g/L蔗糖。

表6 NAA對幼苗生根的影響Table 6 Effect of NAA on rooting of shoots

3 討論

不同消毒方式對蘭州百合外層鱗片的滅菌效果顯示,浸泡洗衣粉,無菌水沖洗,70%無水乙醇處理1～2 min,無菌水沖洗,15%的84消毒液處理15 min,最后0.1%開汞處理8～12 min,無菌水沖洗3遍的方法是較適用于蘭州百合的外殖體滅菌。采用相同的滅菌劑進(jìn)行滅菌,但滅菌劑的使用順序、濃度、時間都會影響外殖體的污染程度和成活率。如果升汞濃度過高,處理時間較長,則會導(dǎo)致外殖體細(xì)胞死亡,降低外殖體成活率。單獨(dú)使用84消毒液,其滅菌能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于升汞,容易導(dǎo)致外殖體污染。對鱗莖的中層、外層、內(nèi)層鱗片用同樣的滅菌方式,鱗片的污染率不同,內(nèi)層鱗片的污染率低于中層鱗片,中層鱗片的污染率低于外層鱗片。內(nèi)層鱗片成活率也高于中層鱗片和外層鱗片。

培養(yǎng)基中的鹽濃度水平既反映出百合在不同生長發(fā)育階段器官發(fā)生和增長對營養(yǎng)素需求的特點(diǎn),又影響培養(yǎng)基中滲透壓的變化,從而影響到細(xì)胞、組織和器官生長發(fā)育的生理生化代謝過程。在蘭州百合誘導(dǎo)分化和繼代培養(yǎng)中,以MS全量鹽濃度較適宜,生根培養(yǎng)則以1/2 MS鹽濃度較適宜。

試驗(yàn)誘導(dǎo)蘭州百合初代培養(yǎng)中,也添加了2,4-D,當(dāng)6-BA、IAA的濃度相當(dāng)時,2,4-D對出芽頻率并沒有明顯的促進(jìn)作用。所以,在初代培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)蘭州百合不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

增殖培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)的濃度要降低,以防增殖芽苗基部愈傷化,以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA對不定芽增殖效果最好。培養(yǎng)基中,生長調(diào)節(jié)劑之間的協(xié)同作用對于外殖體的生長發(fā)育有重要影響。以MS為基本培養(yǎng)基,附加低濃度水平的6-BA與NAA組合,使蘭州百合不定芽形成明顯的叢生芽苗(如D3、D4、D5處理),而高濃度6-BA與 NAA的組合則極顯著降低培養(yǎng)效果(如D18處理)。

培養(yǎng)基1/2 MS+0.2 mg/L NAA+蔗糖60 g/L對幼苗生根培養(yǎng)最適宜,NAA濃度為0.2～0.3 mg/L是促進(jìn)小鱗莖生根的最佳濃度,NAA濃度偏高或偏低都會降低小鱗莖生根的能力。蔗糖濃度對幼苗生根率幾乎沒有影響,但對結(jié)鱗莖有一定的作用[11,12]。蔗糖濃度過低,不利于無菌苗結(jié)鱗莖,不僅結(jié)鱗莖率降低,且鱗莖直徑偏小;若蔗糖濃度偏高,鱗莖新葉不易抽出,其色澤也變暗[13]。蔗糖對蘭州百合幼苗結(jié)鱗莖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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