膠原/PLLA納米粒子復(fù)合海綿的制備及其生物相容性評(píng)價(jià)

盧偉 馮玉杰 巖小麗 樊渝江

支架材料是組織工程的重要因素之一，不僅提供細(xì)胞生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)和幾何形狀，而且影響細(xì)胞的黏附、增殖和分化，是組織工程中不可或缺的一環(huán)［1-3］。膠原是一類蛋白質(zhì)材料，不僅可為細(xì)胞提供支持保護(hù)作用，而且與細(xì)胞的粘附、增殖、分化、表型表達(dá)均有密切關(guān)系，是組織工程中常用的支架材料［4］。但由于膠原本身力學(xué)強(qiáng)度較低而常常無(wú)法維持需要的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。將生物降解合成高分子材料(PLLA、PLGA等)與膠原共混制備復(fù)合材料是提高其力學(xué)性能的常用方法［5］，但疏水性的PLA、PGA和PLGA等與親水性的膠原間缺乏親和力。本文制備了表面親水PLLA納米粒子/膠原復(fù)合支架，提高了力學(xué)強(qiáng)度，降低降解率，細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)表明其具有良好的細(xì)胞相容性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 PLLA納米粒子的制備及表征 將PLLA粉料分散于雙氧水中，紫外光照4 h，水洗、干燥，然后用水分散，與丙烯酸和硫酸亞鐵銨在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)30 min，經(jīng)純水和乙醇反復(fù)洗滌后干燥。產(chǎn)物用四氫呋喃溶解，去離子水透析，凍干后得到表面改性后PLLA納米粒子。用SEM和DLSP表征其形貌，粒徑和zeta電位。

1.2 膠原/PLLA納米粒子復(fù)合支架材料的制備 在膠原醋酸溶液中加入不同量的PLLA納米粒子，使其均勻分散，在20℃凍干，經(jīng) 100 pa，105℃真空干熱交聯(lián) 48 h，50 mmol的EDC和NHS溶液交聯(lián)48 h。用SEM觀察其形貌。

1.3 孔隙率和密度 將稱重后(W0)的海綿支架浸泡在乙醇中，減壓處理20 min后，將海綿取出稱質(zhì)量We。

孔隙率:P=(We-W0)/(Vs)×100%。

密度:D=W0/Vs。

式中，為室溫下乙醇密度(0.789 mg/ml)，Vs由海綿高度和橫截面計(jì)算。

1.4 濕態(tài)壓縮模量 將支架材料浸泡在PBS中，經(jīng)真空處理使PBS溶液完全滲透。然后用萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)量壓縮模量。

1.5 降解率 將支架材料稱重(W0)，分別裝入培養(yǎng)板，加入PBS溶液于37℃靜置。定期取樣凍干稱重(Wd)。降解率 =(W0-Wd)/W0×100%。

1.6 體外細(xì)胞播種及檢測(cè) 支架滅菌清洗后，用培養(yǎng)基浸泡至溶脹平衡。將L929細(xì)胞(1×107/ml)滴加到支架上(100 L/片)，培養(yǎng)4 h使細(xì)胞黏附，然后加入1.5 ml新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在不同時(shí)間取樣，用CLSM、SEM觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)情況。用木瓜蛋白酶消化試樣，用H33258染色，測(cè)460 nm的吸收值檢測(cè)DNA量。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLLA納米粒子的制備及表征 在雙氧水中紫外福照作用下，PLLA表面形成過氧基團(tuán)，與二價(jià)鐵離子氧化還原體系引發(fā)丙烯酸在PLLA表面自由基接枝共聚，形成PLLA-g-PAA接枝共聚物。由于丙烯酸鏈的引入，PLLA表面形成親水鏈段。將接枝共聚物溶于四氫呋喃，在水中透析，可形成能在水中穩(wěn)定存在的納米粒子。SEM和DLS測(cè)試表明，納米粒子為均勻的球形，平均粒徑為316 nm，zeta電位為-39.88 mV，說(shuō)明其表面由帶負(fù)電荷的聚丙烯酸所覆蓋。

2.2 膠原/PLLA納米粒子復(fù)合支架材料的制備與表征 表面改性的PLLA納米粒子可與膠原溶液均勻混合，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象及沉淀的產(chǎn)生。經(jīng)冷凍干燥和交聯(lián)處理，得到多孔膠原/PLLA納米粒子復(fù)合支架材料。SEM觀察表明，其平均孔徑約為200 μm，PLLA納米粒子含量增加，其平均孔徑基本無(wú)變化。但孔壁厚度和表面粗糙程度增加。對(duì)于組織工程支架材料，200 μm的孔徑適合細(xì)胞的播種，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的交換，以及新生組織的形成?？妆诤穸鹊脑黾邮沟弥Ъ芰W(xué)強(qiáng)度提高，而表面粗糙度的增加使細(xì)胞貼壁和粘附生長(zhǎng)更為容易。

圖1為不同PLLA納米粒子含量的多孔支架材料的空隙率和密度。由圖可見，隨著PLLA納米粒子含量的提高，復(fù)合海綿的孔隙率基本無(wú)變化，但密度性增加。由于組織工程支架孔隙率的大小直接決定著支架營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的大小程度，足夠大的支架孔隙率將使得更多的細(xì)胞粘附生長(zhǎng)。

圖1 不同納米粒子含量的復(fù)合支架材料的孔隙率(A)和密度(B)

圖2為不同PLLA納米粒子含量的多孔支架材料的濕態(tài)壓縮模量。由圖可見，同純膠原多孔支架相比，PLLA納米粒子的加入大大提高了海綿的濕態(tài)模量。隨著PLLA納米粒子量的增加，粒子的物理增強(qiáng)作用，以及其表面上丙烯酸的羧基與膠原氨基反應(yīng)形成的化學(xué)鍵增強(qiáng)，使得海綿壓縮模量從0.78 kpa(Col:NP=6:0) 增加到 1.3，2.5，和3.5 kpa(Col:NP=6:1，6:3和6:6，)。其強(qiáng)度大小可以通過調(diào)節(jié)PLLA納米粒子含量調(diào)節(jié)。

圖2 不同納米粒子含量的復(fù)合支架材料的濕態(tài)壓縮模量

由于PLLA納米粒子表面的羧基與膠原分子氨基反應(yīng)后，增加了支架材料德交聯(lián)程度，多孔支架材料的降解率隨著PLLA納米粒子含量的增加而降低。純膠原多孔支架在14 d后降解達(dá)70%以上，而Col:NP=6:6的復(fù)合支架材料在14 d后的降解率仍然低于10%，這為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖提供了更持久穩(wěn)定的空間環(huán)境。

3.3 體外細(xì)胞播種及培養(yǎng) 膠原/PLLA納米粒子復(fù)合支架材料由于PLLA納米粒子的添加，改善了其機(jī)械性能，使支架的穩(wěn)定得以提高，從而有利于細(xì)胞的播種和增殖。圖3為細(xì)胞播種由24h后的CLSM結(jié)果。由圖中可見，隨PLLA納米粒子含量的增加，支架上細(xì)胞數(shù)量明顯增加，可見細(xì)胞成片粘附在海綿孔壁上。這說(shuō)明支架材料力學(xué)性能的提高有利于細(xì)胞遷移到支架材料內(nèi)部，并增加細(xì)胞的粘附。支架材料穩(wěn)定性的增加使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的交換和生理代謝廢物的排出更為容易，對(duì)細(xì)胞的增殖體現(xiàn)出促進(jìn)作用。對(duì)培養(yǎng)1，3，5 d后不同支架材料中細(xì)胞的DNA量進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果表明，隨支架中PLLA納米粒子含量的增加，DNA量從純膠原支架中的0.5 μg增加到Col:NP=6:6的復(fù)合支架材料中的2.5 μg，表明在復(fù)合支架材料中細(xì)胞的數(shù)量有非常明顯的提高。

圖3 不同納米粒子含量的復(fù)合支架材料播種L929細(xì)胞后的CLSM圖像。從左至右:Col:NP=6:0;6:1;6:3;6:6

4 結(jié)論

通過自由基接枝聚合，在PLLA表面引入聚丙烯酸，制備了表面包裹可反應(yīng)性羧基的PLLA納米粒子，并與膠原溶液混合，通過冷凍干燥制備了膠原/PLLA納米粒子復(fù)合支架材料，其孔隙率和孔徑與純膠原支架材料相近，而密度、濕態(tài)壓縮模量均有明顯提高，降解率降低顯著。這種復(fù)合支架材料對(duì)細(xì)胞的粘附的增殖有良好的促進(jìn)作用，可望成為一種有用的組織工程支架材料。

［1］曹峻嶺，付強(qiáng).組織工程化軟骨的構(gòu)建及應(yīng)用.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，29(2):121-126.

［2］Cindy Chung，Jason A.Burdick.Engineering cartilage tissue.Adv Drug Delivery Rev，2008，60:243-262.

［3］鄂征，劉流.醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)與臨床應(yīng)用.北京出版社，2003.

［4］T.Bhardwaj，R.M.Pilliar，M.D.Grynpas，R.A.Kandel.Effect of material geometry on cartilagenous tissue formation in vitro.J Biomed Mater Res，2001，57:190-199.

［5］G.Chen，T.Ushida，T.Tatsuya，Hybrid Biomaterials for Tissue Engineering:A Preparative Method of PLA or PLGA-Collagen Hybrid Sponge.Adv Mater，2000，12:455.