高速逆流色譜法分離純化白鮮皮中梣酮的初步研究

張紅晶，王 琦，時東方，趙立春，王 晶，吳桂梅，劉春明*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2. 長春師范學(xué)院，吉林 長春 130032； 3. 河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002）

高效離心分配色譜（HPCPC）技術(shù)是高速逆流色譜技術(shù)的一種，是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同，從而實現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。高速逆流色譜法不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜處理，與傳統(tǒng)柱層析法相比，它具有分離速度快、樣品吸附低、分離重現(xiàn)性好、不會吸附、污染、損失樣品等優(yōu)點(diǎn)[1]。根據(jù)紫外吸收色譜圖可良好重復(fù)收集樣品，若與制備液相色譜結(jié)合，則可快速、大量的制得相應(yīng)純度的標(biāo)準(zhǔn)品[2]。高速逆流色譜在生物堿、黃酮、酚類、醌類、苷類、脂肪酸、多肽等化合物分離中得到廣泛應(yīng)用[3～4]。

白鮮皮為蕓香科白鮮屬植物白鮮（Dictamnus dasycarpus）和狹葉白鮮（D. angus tifolius）的干燥根皮，具有祛風(fēng)、燥濕、解毒等功效[5]。近年來的研究表明，白鮮皮中的化學(xué)成分主要有兩類：生物堿類和內(nèi)酯類，其中梣酮（fraxinellone）作為新型的肝病治療藥物，具有良好的保肝降酶及抑制肝纖維化等活性，并具有抑菌、殺蟲等活性[6]。目前，梣酮的藥理作用已成為國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)，分離制備梣酮單體對進(jìn)一步開發(fā)新的天然藥物具有十分重要的意義。本文采用HPCPC分離、純化、制備中藥白鮮皮活性成分梣酮，為制備白鮮皮有效成分的化學(xué)對照品提供了一種簡捷實用的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鮮皮，購于北京同仁堂藥店（長春分店）；梣酮標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、甲醇、正丁醇及乙醇（分析純，北京化工廠）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（18.2ΩPa）。

1.2 儀器與設(shè)備

HPCPC-80型高效離心分配色譜儀（日本），檢測器為UV檢測器；Waters 2695-2998型高效液相色譜儀（美國），PDA檢測器，C18色譜柱（150×4.6 mm，5μm）和C18保護(hù)柱；S180H超聲波提取儀（德國Elma公司）；BS-124S型電子天平（Sartorius德國）；HS-Z11-Ⅱ電熱蒸餾水器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；純水器（法國Milli Q公司）。

1.3 白鮮皮粗提物的制備

白鮮皮粉碎后精確稱取50 g，用85%乙醇溶液，料液比1：20，在80℃水浴中提取2次，每次提取1 h，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收乙醇，濃縮液置真空干燥箱中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 高速逆流色譜

1.4.1 溶劑系統(tǒng)選擇 應(yīng)用高速逆流色譜儀分離樣品時，溶劑系統(tǒng)的選擇是最關(guān)鍵的問題。選擇溶劑系統(tǒng)一般遵循以下原則：①形成穩(wěn)定的兩相溶劑體系，沉降時間小于30 s，保留率大于50%；②不造成樣品的分解與變性，避免選擇毒性大的溶劑；③樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)，一般在0.5 ～ 2.0[7]。選用正丁醇-乙酸乙酯-水、正丁醇-乙酸乙酯-乙醇-水、正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水3個系統(tǒng)作為分離梣酮的溶劑系統(tǒng)。

1.4.2 沉降時間的測定方法 在10 mL刻度試管中按溶劑系統(tǒng)的比例加入混合溶劑，充分振蕩后靜置，分層的時間記為沉降時間。

1.4.3 分配系數(shù)K的測定方法 在10 mL試管中按照選定的比例分別加入各種溶劑，充分振搖，靜置分層，分取上、下層溶液各1 mL，加入少量白鮮皮乙醇提取物，再經(jīng)過充分振蕩，靜置分層，然后分別取上下層溶液各500μL，過 0.45μm微孔濾膜，利用高效液相色譜法測定溶劑體系上、下相所含樣品的濃度，以下相中組分峰面積與上相中組分峰面積的比來求得樣品中各類成分在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)（K）。流動相為甲醇：水 = 58：42（V/V），柱溫25℃，流速為0.80 mL/min，檢測波長228 nm。

1.4.4 HPCPC分離 將按比例配置的溶劑系統(tǒng)在分液漏斗中混合，充分振蕩，靜置約20 min，分離后超聲脫氣20 min。將上相（固定相）以3.0 mL/min的流速泵入并確定充滿分離螺線管后暫停泵的工作，同時按選定的轉(zhuǎn)速啟動主機(jī)、開啟檢測器，以228 nm波長進(jìn)行檢測。等待主機(jī)轉(zhuǎn)動穩(wěn)定后將下相(流動相)以選定的流速泵入，待流動相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入（樣品為白鮮皮乙醇提取物分別用1 mL溶劑系統(tǒng)的上下層溶解）。管柱出口處的流出物經(jīng)紫外檢測器檢測，將各峰對應(yīng)的收集液分別濃縮，待測。

1.5 HPLC純度檢測 對白鮮皮樣品和經(jīng)HPCPC分離純化所收集的純化液進(jìn)行HPLC圖譜分析。液相條件如下：流動相為甲醇：水 = 58：42（V/V），柱溫25℃，流速0.8 mL/min，檢測波長228 nm；色譜柱為：SunFireTMC18（4.6×150 mm，5μm）；進(jìn)樣量為10μL。

表1 不同溶劑體系的分配系數(shù)比較Table 1 Comparison among isolation parameters of different solvent systems

2 結(jié)果與分析

2.1 HPCPC溶劑系統(tǒng)的選擇結(jié)果

由表1可以看出，梣酮在溶劑系統(tǒng)1和2中的分配系數(shù)遠(yuǎn)大于5，而系統(tǒng)3和4的分配系數(shù)遠(yuǎn)小于1，都不適合；結(jié)合實際上機(jī)實驗結(jié)果分析，我們選擇HPCPC溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:1:1:1，V/V），進(jìn)行對白鮮皮中梣酮的分離。

2.2 HPCPC分離結(jié)果

白鮮皮粗提物的高速逆流色譜分離圖譜見圖1。由圖1可見，在本實驗條件下經(jīng)HPCPC分離純化150 min后，得到2個較明顯的峰。分別收集這2個峰，經(jīng)濃縮干燥并采用HPLC對它們的純度進(jìn)行檢測。

2.3 HPLC純度分析結(jié)果

樣品及各分離峰色譜圖如圖2、圖3所示。經(jīng)HPLC檢測，用峰面積歸一法測得峰2接收液純度達(dá)到99%以上。

圖1 白鮮皮粗提物的高速逆流色譜分離圖Figure 1 HPCPC of extract from D. dasycarpus

圖2 白鮮皮樣品HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of extract from D. dasycarpus

圖3 分離得2號峰接收液HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatogram of fraction No.2 obtained by HPCPC

圖4 梣酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Figure 4 HPLC chromatogram of standard Fraxinellone

3 結(jié)論

本實驗應(yīng)用高速逆流色譜法對白鮮皮粗提物進(jìn)行了分離純化，在溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:1:1:1，V/V）時分離得到一個單體化合物和兩個混合物組分（分別占 40%和 60%）。通過與標(biāo)準(zhǔn)品及已知文獻(xiàn)[8]對比，初步確定峰2為單體化合物梣酮，按照HPLC色譜峰面積計算，其含量高于99%。應(yīng)用HPCPC 分離白鮮皮中的化學(xué)成分，由于不用固態(tài)載體作固定相，避免了載體填充所形成的不可逆吸附，減少了樣品的損耗，具有簡便、快速、分離效率高等特點(diǎn)，對于有效的分離純化內(nèi)酯類物質(zhì)具有較好的實際應(yīng)用價值；另外，樣品可以作為標(biāo)準(zhǔn)品用于藥物分析或藥理與毒理實驗，為梣酮的進(jìn)一步定性和結(jié)構(gòu)鑒定提供一定的幫助。

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