大孔樹脂分離純化苦參總黃酮提取工藝研究

謝燕賢(深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院，深圳市 518000)

中藥苦參(Sophora fiavescens)又名山槐子，為豆科植物苦參的干燥根，苦參提取液中的化學成分主要分為生物堿和黃酮兩大類。近年來對它研究的重點多在生物堿上，對其中的黃酮類成分研究較少，到目前為止，已從苦參根中共分離得到了44種異戊烯基黃酮類化合物，具有健胃、利尿、消炎、止瀉和驅蟲等多種生物活性功能［1］。一系列從苦參中分離出的含異戊烯基的苦參黃酮在體外對一些人腫瘤細胞株有細胞毒活性，例如有效于人白血病 HL－60、K562，小鼠白血病 L1210［2］等等。苦參總黃酮提取液對細菌的抑制活性研究表明。對革蘭陽性金葡菌有較強的抑制作用，對革蘭陰性菌大腸桿菌的抑制作用較弱。其原因可能與細胞壁的結構組分不同有關?？鄥ⅫS酮粗提液還對啤酒酵母、產(chǎn)黃青霉、黑曲霉都有抑制作用［3］。

本文采用大孔吸附樹脂的分離的技術提取苦參中的總黃酮。利用AB－8型、HPD－100型、HPD－101型、HPD－400型、HPD－417型、HPD－450型、HPD－600型7種大孔吸附樹脂，采用靜態(tài)、動態(tài)吸附法及吸附動力學試驗分離純化苦參總黃酮的性能進行了對比，篩選七種樹脂中最適于分離純化苦參總黃酮的樹脂。有關研究如下。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

島津UV－2401分光光度計;賽多利斯電子天平;樹脂型號為AB－ 8型、HPD－100型、HPD－101型、HPD－400型、HPD－417型、HPD－450型、HPD－600型;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號1115382－200301);其他試劑均為分析純。

1.2 樹脂預處理［4］

取上述各型號大孔樹脂，用一定體積分數(shù)乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用適當體積分數(shù)的乙醇洗至出液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇備用。即可。

1.3 苦參藥液的提取

稱取一定量的苦參干燥藥材，用90%乙醇，水浴回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水溶解，即得苦參樣品液。

1.4 樹脂的選擇

準確稱取上述準備的大孔樹脂濕樹脂各5 g，置具塞磨口三角瓶中，加入苦參樣品液25 mL，25℃恒溫振蕩24 h，過濾、保留濾液，用蒸餾水洗滌樹脂，再將樹脂浸泡在70%乙醇中，25℃恒溫振蕩24 h解吸，測定各液中總黃酮的濃度。

2 含量測定方法［5］

2.1 蘆丁標準曲線的制備

精確稱取蘆丁對照品14.6 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至 50 mL，搖勻，配成 292 μg·mL－1的標準溶液，備用。精密吸取對照品溶液 0、2、4、6、8、10mL、分別置于25 mL容量瓶中，分別加70%乙醇至10 mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液 l mL，混勻，靜置。精密加入10%硝酸鋁溶液 l mL，搖勻后靜置，精密加入4%氧氧化鈉溶液10 mL，再加70%乙醇至刻度，搖勻，放置 15 min.以第一管做空白在波長 510 m處測定吸光度，以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果見表1。

表1 蘆丁對照品標準曲線Tab 1 Standard curve ofrutoside control

上述數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，進行回歸，得回歸方程:Y=0.020 5X+0.007 8，r=0.999 8。結果表明，本品在 23.36 ～116.80 μg·mL－1范圍內(nèi)，濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 苦參提取液總黃酮的測定方法

參照文獻報道，目前已知從苦參根中共分離得到了多種黃酮類化合物，所以其總黃酮含量的測定以蘆丁為對照品進行測定。方法為，取待測樣品2份，減壓濃縮至干浸膏，取干浸膏用乙醇溶解，按“標準曲線的制備”項下方法，測定、并計算樣品中總黃酮的含量。

3 樹脂吸附實驗

表2 不同樹脂對苦參總黃酮的吸附和解吸能力Tab 2 Adsorption and desorption of different resins on total flavonoids in Sophora Flavescens

3.1 樹脂對苦參總黃酮的選擇性

通過計算公式:吸附量 =V(C0－C1)/M、吸附率 =［(C0－C1)/C0］×100%、解吸量 =C2×V/M、解吸率 =［C2/(C0－C1)］×100%(式中C0為吸附前樣液中黃酮濃度，C1為吸附后上清液中黃酮濃度，C2為解吸液中黃酮濃度，V為樣液體積，M為濕樹脂質(zhì)量)。研究了7種樹脂對苦參總黃酮的選擇吸附性，結果見表2。

結果顯示，HPD－101型大孔樹脂對苦參總黃酮的吸附和解吸能力都最大，所以采用HPD－101型號為苦參總黃酮的提取富集樹脂。

3.2 靜態(tài)吸附等溫線的建立

準確稱取5 g HPD－101濕樹脂于具塞三角瓶中，加一定濃度的料液各25 mL，于18℃、25℃、30℃下靜態(tài)吸附，每隔2 h取樣1.0 mL，測定各個時段取樣液中總黃酮濃度，繪制靜態(tài)吸附等溫線。根據(jù)靜態(tài)吸附實驗，24 h樹脂完全達到吸附平衡，計算出吸附量 q。q=V0(C0－C1)/M，(q為吸附量，mg·g－1為濕樹脂;C0為初始黃酮溶液濃度 mg·mL－1，C1為黃酮溶液的平衡濃度 mg·mL－1，M為濕樹脂的質(zhì)量 g)。以吸附時間為橫坐標，吸附量為縱坐標，繪制吸附等溫線如圖1。

圖1 HPD－101對苦參總黃酮的吸附等溫線Fig 1 Adsorption isotherm of HPD－101 on total flavonoids in Sophora Flavescens

從圖1可以看出，HPD－101型樹脂在25℃時的苦參總黃酮吸附效果最好，溫度過高或過低樹脂的平衡吸附量均下降。

3.3 靜態(tài)吸附動力學曲線的建立

準確稱取5 g HPD－101型樹脂于具塞三角瓶中，加一定濃度的料液各25 mL，于25℃下靜態(tài)吸附，每隔2 h取樣1.0 mL，測定各個時段取樣液中總黃酮濃度，繪制吸附等溫線。吸附動力學特征反映的是隨時間的延長，樹脂對樣品分子吸附量的變化趨勢。經(jīng)過i次取樣后，總黃酮濃度C與吸附量q之間的關系可用下式表示:q=Σ (Ci－1－Ci)(V0－0.5i)/m(i=1 － n)，(q為吸附量，mg·g－1濕樹脂;C 為總黃酮濃度，mg·mL－1;m為濕樹脂的質(zhì)量g)。以吸附時間 h為橫坐標，剩余濃度Ci為縱坐標繪制動力學曲線，如圖2。

圖2 25℃時HPD－101型樹脂對苦參總黃酮吸附動力學曲線Fig 2 Adsorption dynamics curve of HPD－101 on total flavonoids in Sophora Flavescens at 25℃

從圖2可以看出，HPD－101樹脂對總黃酮的吸附量在4 h內(nèi)較大，吸附速度快，在4～6 h內(nèi)吸附速度慢，在6 h后速度趨于平緩，在6 h時達到最大吸附。因此靜態(tài)吸附6 h即可達到吸附飽和。

3.4 動態(tài)吸附實驗

分別稱取HPD－101樹脂25 g 4份，濕法裝入4根3 cm×50 cm 色譜柱中。選擇 4 個濃度藥液(1.0、2.0、3.0、4.0 mg·ml－1)，加入量依次為 300、250、200、150 mL ，以 1.0 mL·min－1的上樣速度、70%乙醇洗脫，洗脫液定容至500 mL，測定總黃酮含量后濃縮，烘干，并稱重洗脫物，見表3。

表3 苦參動態(tài)吸附實驗考察結果Tab 3 Dynamic adsorption experiment onSophora Flavescens

從表2可以看出，上樣液濃度為3.0 mg·mL－1時，洗脫的總黃酮量最大，純度最高，濃度過高或過低都對總黃酮的洗脫量有影響。

3.5 靜態(tài)解吸條件選擇

稱取20 g HPD－101型樹脂于燒杯中，加入一定濃度的料液100 mL，靜態(tài)吸附24 h，濾出樹脂，過濾后按質(zhì)量平均分成10份，分別置于10個錐形瓶中，各加入 10%、20%、30%，40%、50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液，靜態(tài)解吸24 h。抽濾，并用各自的洗脫劑沖洗樹脂，合并入濾液，置于100 mL的量瓶中，得到洗脫液，測定各自的總黃酮含量，并計算解吸量。洗脫效果見圖3。

圖3 不同醇度的洗脫劑對總黃酮解吸量的影響Fig 3 Effects of different ethanol concentration of eluting agents on desorption amount of total flavonoids

從圖3可以看出，當醇度達到70%時，解吸量達到最大，因此可以選擇70%的乙醇作為洗脫劑。

4 討論

中藥水提液通常采用醇沉法來進行精制，盡管醇沉法具有澄清藥液、減少服用量等優(yōu)點，但也存在許多不足，如總固形物和有效成分損失嚴重，乙醇損耗量大、生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長，安全性差等等。大孔吸附樹脂是近年來新發(fā)展起來的精制技術，在醫(yī)藥領域中廣為應用，是提取精制中草藥中水溶性有效成分的一種有效方法。本文采用HPD－101大孔樹脂分離技術提取苦參中的總黃酮。旨在探索一條適用于中藥提取的新方法。

通過研究證明，苦參以90%乙醇為溶劑，水浴回流提取3次，總黃酮能得到較好的提取效果。經(jīng)過靜態(tài)、動態(tài)吸附實驗、吸附等溫線的建立、吸附動力學曲線的建立、解吸條件優(yōu)化，研究了七種樹脂對苦參總黃酮的選擇吸附性，研究表明HPD－101樹脂對苦參總黃酮具有較好的選擇吸附性和解吸能力，當洗脫劑醇度達到70%時，解吸量達到最大。

［1］唐 詡，許東暉，梅雪婷，等.26種黃酮類天然活性成分的藥理研究進展［J］.中藥材，2003，26(1):46.

［2］趙玉英，王 郇，雷黎明，等.苦參黃酮類成分的研究［J］.植物學報，1993，35(4):304.

［3］張慶平.苦參總黃酮超臨界CO2萃取及其抑菌作用的研究［J］.海峽藥學，2009，21(7):46.

［4］高紅寧，金萬勤，郭立瑋.微濾 －大孔樹脂法精制苦參中氧化苦參堿和苦參總黃酮［J］.西北藥學雜志，2001，19(1):12.