表面等離子體共振生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用與研究

戴明

（福建省中心檢驗所，福建 福州 350002）

表面等離子體共振生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用與研究

戴明

（福建省中心檢驗所，福建 福州 350002）

表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）傳感技術(shù)是一項新興的生物化學(xué)檢測技術(shù)，具有無須標記、高速、高靈敏度等特點。目前在化學(xué)和生物檢測研究中應(yīng)用日益廣泛。本文綜述了SPR技術(shù)的基本原理及近年來在食品安全領(lǐng)域研究中取得的進展，并展望了SPR技術(shù)的發(fā)展方向及應(yīng)用前景。

表面等離子體共振（SPR）；食品安全；檢測

表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）傳感技術(shù)是一項新興的生物化學(xué)檢測技術(shù)。它是基于表面等離子體共振的物理光學(xué)現(xiàn)象的敏感折射率的高精度光學(xué)傳感器，通過感測傳感器表面的折射率微小變化而實現(xiàn)生物分子的傳感，是研究生物分子相互作用的有力工具,其具有無須標記、高速化、專一性、靈敏度高以及大量平行篩選等優(yōu)點。自從1982年被應(yīng)用于氣體測定和生物傳感研究，20多年來得到科學(xué)界越來越多的關(guān)注。各種新型的配置形式及其在物理、化學(xué)、生物領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛研究。隨著表面等離子體共振技術(shù)的發(fā)展成熟，多家儀器公司實現(xiàn)了相關(guān)檢測儀器的商品化，該類設(shè)備成為實時分析，簡便快捷地監(jiān)測DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間以及藥物—蛋白質(zhì)、核酸—核酸、抗原—抗體、受體—配體等等生物分子之間的相互作用的重要手段，在生命科學(xué)、醫(yī)療檢測、藥物篩選、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、毒品檢測、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用需求。

一、SPR基本原理

表面等離子體共振（SPR）是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。它是利用金屬表面電荷波動（表面等離子波）在某一適當?shù)娜肷浣腔虿ㄩL與入射光TM極化能量（消失波）耦合產(chǎn)生表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）。如果金屬表面介質(zhì)的折射率或被測物介電常數(shù)發(fā)生變化, 共振峰的位置（共振角或共振波長）將發(fā)生改變[1]。因此通過測定共振角（或波長）變化, 就可獲得被測物在界面上發(fā)生反應(yīng)的信息。

在基于SPR原理的生物傳感器中，使用最多、應(yīng)用最廣泛的是GE公司生產(chǎn)的Biacore儀器，并由此發(fā)展出生物分子相互作用分析技術(shù)（Biomolecular Interaction Analysis,BIA）。在BIA的測定中是通過在SPR傳感器反應(yīng)界面上修飾一層配體分子, 當被分析物與配體分子結(jié)合后, 共振峰的位置會發(fā)生位移, 該位移的大小將反映固定在金屬表面的物質(zhì)的量, 進而監(jiān)測分子間相互作用，其檢測原理如圖1所示。

由于SPR生物傳感器具有靈敏度高、實時快速、樣品無需標記等突出優(yōu)點，因而有關(guān)SPR傳感器的研究與應(yīng)用得到迅猛發(fā)展。目前SPR生物傳感器已由最初的生物大分子相互作用（例如：蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、藥物－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－核酸、核酸－核酸之間的相互作用分子間）研究逐漸發(fā)展到用于環(huán)境污染物和食品安全中眾多小分子化合物的檢測。

二、SPR技術(shù)在食品品質(zhì)與安全檢測中的應(yīng)用

隨著表面等離子共振傳感技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域逐漸為人們接受，關(guān)于SPR生物傳感器的分析研究與論文也不斷增加，其應(yīng)用于食品安全與品質(zhì)的檢測主要包括病原體、毒素、藥物殘留、維生素、荷爾蒙、抗體、化學(xué)污染物、過敏源和蛋白。

（一）病原體

近年來，SPR傳感技術(shù)已用于各種病原體的檢測，其中包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲。早在1998年，F(xiàn)ratamico 等[2]就用SPR檢測手段測定可大腸桿菌O157:H7（E.coli O157:H7）。隨后，大量的SPR技術(shù)檢測大腸桿菌O157:H7的工作被陸續(xù)報道。Choi’s課題組[3]利用商品化的SPR儀—Multiskop測定大腸桿菌O157:H7，他們在芯片上先修飾一層蛋白G來固定抗E.coli O157:H7抗體然后直接檢測E.coli O157:H7，其檢測靈敏度可達104/cell。2006年 Subramanian等[4]在芯片表面修飾硫醇自組裝膜，氨基偶聯(lián)法將抗E.coli O157:H7多克隆抗體固定在芯片上，利用夾心SPR檢測法測定，靈敏度可達103cfu/mL。2007年，Waswa等[5]利用Speeta SPR儀，先將生物素化的抗E.coli O157:H7抗體固定到預(yù)先修飾有中性鏈親和素的金膜表面，這種抗體固定方式大大改善了方法的靈敏度，可實現(xiàn)牛奶、蘋果汁、碎牛肉等復(fù)雜體系中E.coli O157:H7的檢測，其檢測限可達102-103cfu/ml。Zezza等[6]測定了小麥里的黃色鐮刀菌。先提取樣品中DNA，再將黃色鐮刀菌的特異性DNA片段放大，然后檢測擴增物，通過與已固定在SPR芯片表面的互補序列雜化檢測黃色鐮刀菌。

（二）毒素

食品安全所涉及的毒素主要是由細菌、真菌、水藻所產(chǎn)生的。2000年，Nedelkov等[7]用Biacore X SPR儀在葡聚糖芯片表面氨基偶聯(lián)抗金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal Enterotoxin B，SEB）抗體，直接檢測牛奶和蘑菇的SEB量可低至1ng/ml[8]。SPR儀后串接一個MALDI-TOF來對已結(jié)合的毒素確證。Medina等[9]利用商品化Biacore1000 SPR儀，競爭SPR法檢測雞蛋里的SEA (金黃色葡萄球菌腸毒素A)。首先將SEA氨基偶聯(lián)在葡聚糖芯片上。生雞蛋碾碎均勻后離心，然后向其中加入抗SEA抗體，待SEA和其抗體反應(yīng)后離心，使得抗原-抗體結(jié)合物與未反應(yīng)的抗體分離。取上清液，注樣使樣品流過SEA芯片表面。該方法的SEA檢測限可達1ng/ml。Lotierzo等[10]采用Biacore 3000，在芯片上修飾分子印跡聚合物作為識別元素采用競爭SPR法測定軟骨藻酸DA。具體做法是將含有DA和辣根過氧化物酶修飾的DA的樣品與以DA為模板的分子印跡聚合物競爭反應(yīng)。2005年，Yu等[11]采用抑制法用自行搭建的SPR儀測定DA。Traynor等[12]也利用抑制SPR法測定了貝殼提取物中的DA。

（三）獸藥

SPR生物傳感技術(shù)應(yīng)用的另一個重要領(lǐng)域就是食品中獸藥殘留檢測[13]（例如：抗生素、β-阻斷劑、抗寄生蟲藥），且目前這方面的應(yīng)用還在不斷增加。Cacciatore等[14]檢測了牛奶中抗生素含量（盤尼西林、頭孢），他們利用β-內(nèi)酰胺類抗生物對digoxigenin標記氯芐青霉素與水溶性肺炎鏈球菌盤尼西林結(jié)合蛋白2×衍生物結(jié)合產(chǎn)生非競爭抑制作用，使用的是Biacore 3000 SPR儀將抗digoxigenin抗體預(yù)先固定在芯片上。測得牛奶中各種抗生素的檢出限如下:芐青氯素、氨芐青霉素、阿莫西林2ng/ml，鄰氯青霉素15ng/ml，頭孢氯芐50ng/ml，頭孢哌酮鈉25ng/ml。Ashuin等[15]測定了食物中氯霉素和氯霉素葡萄糖苷酸。他們測定了蜂蜜、蝦、乳制品中的氯霉素和豬腎里的氯霉素葡萄糖苷酸可低至0.2μg/kg。Dumont等[16]利用Biacore Q抑制檢測法測定了蝦體內(nèi)殘留的氟苯尼考（fenicol）。2007年Moeller等[17]報道了蜂蜜和牛奶中的四環(huán)素（tet）藥物的檢測。該方法的機理是四環(huán)素從四環(huán)素操縱子（tetO）中釋放出四環(huán)素遏制蛋白（TetR）對革蘭氏陰性菌中四環(huán)素產(chǎn)生遏制。含有四環(huán)素操縱子序列的biotinated-單鏈DNA固定在鏈霉親和素芯片表面上，然后TetR與芯片表面的tetO結(jié)合，注入含有四環(huán)素的樣品使四環(huán)素與TetR反應(yīng)，TetR蛋白構(gòu)型發(fā)生變化從芯片表面脫離，SPR檢測到的是芯片表面密度的減少。緩沖溶液中tet的檢測限為1ng/ml，牛奶和蜂蜜中的分別為15ng/ml和25μg/kg。

（四）激素

Gillis等[18，19]測定了奶牛新產(chǎn)乃中甾體類激素黃體酮。黃體酮衍生物氨基偶聯(lián)固定在葡聚糖表面上，一定已知濃度的單克隆抗體與樣品（緩沖溶液或牛奶）孵育一段時間。SPR檢測為反應(yīng)抗體的量。早在2002年他們就測定了生乳牛奶中黃體酮的含量可低至3.6ng/ml[18]。2006年他們又改進方法將緩沖夜和牛奶黃體酮中檢測限降至60pg/ml和0.6ng/ml[19]。

（五）過敏源

Mohammed等[20]利用商品微型化SPR儀—Spreeta測定可花生過敏原，檢測限為700ng/ml。Malmheden Yman等[21]將雞蛋白、伴白蛋白、芝麻蛋白、花生蛋白、榛仁蛋白、蟹肉等過敏原的親和純化抗體氨基偶聯(lián)在葡聚糖芯片上，利用Biacore Q SPR儀比較了直接檢測和夾心檢測兩種模式，實驗結(jié)果表明夾心法中的二抗提高了檢測的靈敏度和特異性。巧克力中的花生蛋白稀釋10倍后檢測限可達1μg/g，通心粉中的伴白蛋白則達1μg/g，芝麻蛋白為0.25μg/g。

（六）化學(xué)污染物

Samsonona等[22]使用Biacore Q SPR儀抑制法測定了貝殼中4-壬基苯酚。9-羥苯基壬酸氨基偶聯(lián)在葡聚糖涂層上，采用單克隆抗體檢測，緩沖溶液中檢測限為2ng/ml。整個檢測過程包括30秒鐘的重生也只需花不到3min。芯片可用10% 100mM NaOH的乙腈溶液重生，降低了實驗成本。檢測貝殼中4-壬基苯酚的濃度最低可到10ng/ml。一般，用重組牛生長激素處理過的牛奶中會發(fā)現(xiàn)一種可疑致癌物：胰島素樣生長因子（IGF）。Guidi等[23]先將胰島素樣生長因子-1（IGF-1）固定在葡聚糖膜上，anti-IGF-1多克隆抗體與樣品孵育2小時后采用的是抑制免疫檢測法。據(jù)報道，緩沖溶液和牛奶中IGF-1檢測量都可低至10ng/ml。

三、SPR技術(shù)的前景展望

SPR作為生物傳感器具有生物樣品無需標記，分析樣品無需純化，且可實時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程等優(yōu)點，它在生命醫(yī)學(xué)、食品及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域有著巨大的市場潛力，但與之前廣泛應(yīng)用的免疫檢測方法相比，在價格、靈敏度、穩(wěn)定性方法須進一步改進：

（一）降低實驗成本

一臺進口商品化的SPR儀需人民幣200～300萬元，使用過程中還要不斷地消耗昂貴的耗材芯片，SPR實驗高額成本無形中影響了SPR傳感器的研究和應(yīng)用。目前國內(nèi)已有許多研究小組都自行搭建了SPR傳感裝置，大大降低了實驗成本。

（二）陣列化、高通量分析

由于SPR技術(shù)每次只能分析幾個樣品，且每次分析需要大約5～10min，高通量檢測提高了檢測效率，參考通道的引入也確保了測量結(jié)果的精確度和可信度。

（三）提高檢測靈敏度

SPR技術(shù)對待測物濃度的測定主要與物質(zhì)的分子量有關(guān)，對于分子量大于1000的物質(zhì)，其典型的可測定濃度范圍為μmol/L-nmol/L，而對于分子量小于1000的物質(zhì)，其典型的可測定濃度范圍為μ mol/L-mmol/L。因此，積極探索各種高靈敏度的分析方法來檢測小分子已成為SPR研究中的一個主要內(nèi)容?？赏ㄟ^對傳感器結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化、傳感新機制進行研究來達到此目的。

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Development of Surface Plasmon Resonance Technique in theAnalysis of Food Safety

DAI Ming
(Fujian Provincial Central Inspection Institute, Fuzhou 350002, Fujian, China)

Surface plasmon resonance (SPR) biosensor developed rapidly in the recent years by merit of its obviation of sample labeling, rapidness and high sensitivity. The principle and development of SPR technique in analysis of environment pollution substance and food safety analysis was reviewed and tread of SPR in the above area was also prospected.

surface plasmon resonance (SPR); food safety; detection

2009-02-20

戴 明，男，福建省中心檢驗所食品化學(xué)產(chǎn)品檢驗部，工程師，理學(xué)博士