陳建洪 黃南楠 唐倩 吳堅(jiān)
牙周組織在牙周病變過程中因炎癥而被破壞,如何獲得牙周組織結(jié)構(gòu)和功能的重建-即牙周組織的再生,是牙周病研究領(lǐng)域的重要課題。牙周組織缺損的修復(fù)主要針對牙周韌帶、牙骨質(zhì)和牙槽骨的修復(fù)。應(yīng)用組織工程修復(fù)牙周組織缺損為牙周病的治療開辟了一條新途徑。
本實(shí)驗(yàn)中,我們選用第四代的人牙周韌帶細(xì)胞作為種子細(xì)胞,溶膠-凝膠生物活性玻璃(sol-gel bioglass,SGBG)/聚羥基烷酸酯(poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate,PHBV)作為支架材料,通過細(xì)胞支架體外復(fù)合培養(yǎng)的直接接觸實(shí)驗(yàn),檢測材料對人牙周韌帶細(xì)胞分泌功能的影響,為牙周組織工程支架材料的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 材料來源 SGBG/PHBV(華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供)。
1.1.2 主要儀器和試劑 全自動CO2培養(yǎng)箱(Forma,USA),醫(yī)用超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠),倒置相差顯微鏡(Nikon,Japan),純水系統(tǒng)(Millipore,USA),高速離心機(jī)(飛鴿,中國),高糖 DMEM 培養(yǎng)液(Gbico,USA),胎牛血清(PAA,美國),胰蛋白酶(Sigma,USA),MTT 3-(4,5-2 甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(Sigma,USA),抗波形絲蛋白單克隆抗體(博士德,中國),抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(博士德,中國),倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon,Japan),掃描電鏡(PHILIPS XL-30,Holand),羥脯氨酸試劑盒(南京建成,中國)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 PDLCs體外培養(yǎng)[1]取因正畸撥除的第一或第二前磨牙,用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。最早第7天,可見組織塊邊緣游出細(xì)胞。待細(xì)胞長滿瓶底約80%時進(jìn)行首次傳代,4~8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 細(xì)胞來源鑒定 利用免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白單克隆抗體和細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色。
1.2.3 直接接觸法觀察材料形態(tài)和功能
1.2.3.1 支架材料準(zhǔn)備 SGBG/PHBV塊狀多孔支架材料,將塊狀多孔SGBG/PHBV制成5mm×5mm×3mm的方形小塊,過氧化氫等離子低溫滅菌系統(tǒng)消毒,置24孔板內(nèi)用不含F(xiàn)BS的DMEM預(yù)濕過夜后接種細(xì)胞。
1.2.3.2 PDLCs與SGBG/PHBV復(fù)合培養(yǎng) 用0.25%胰蛋白酶消化狀態(tài)良好的細(xì)胞,1000 rpm×5 min離心,將細(xì)胞濃度調(diào)整至 1 ×106/ml,接種于材料上,每塊接種 200 μl,置37℃培養(yǎng)箱中,4 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液1~2 ml,以后隔天換液。
1.2.3.3 細(xì)胞功能的檢測 制備細(xì)胞懸液,對照組共設(shè)27孔,細(xì)胞計(jì)數(shù)后直接接種于兩塊24孔板,5×104個細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)組三維培養(yǎng)接種方法和密度同前,取27塊材料分別培養(yǎng)于兩塊24孔板的27個孔內(nèi)。分別在三維培養(yǎng)后12 h,24 h,48 h,各孔吸出細(xì)胞上清液1 ml,無菌封存,4℃保存。將共組共54份細(xì)胞上清液,按羥脯氨酸試劑盒說明書操作,用分光光度計(jì)在550 nm,空白管調(diào)零,測各管吸光度。
上清液中羥脯氨酸含量(μg/ml)=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2 μg/ml)。
換算成相同細(xì)胞數(shù)的羥脯氨酸含量運(yùn)用SPAA12.11軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及來源鑒定 PDLCs傳代后,細(xì)胞大多呈長梭形,少量呈多角形,胞體豐滿,伸展良好,胞漿均勻,核圓,核仁清晰,細(xì)胞排列均勻,密集時呈漩渦狀,火焰狀。免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白單克隆抗體和細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色,細(xì)胞呈波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,提示細(xì)胞來源為外胚間充質(zhì)。
2.2 化學(xué)比色法測定細(xì)胞分泌功能
表1 上清液羥脯氨酸量(μg/ml)測定值統(tǒng)計(jì)分析表()
表1 上清液羥脯氨酸量(μg/ml)測定值統(tǒng)計(jì)分析表()
n對照組 實(shí)驗(yàn)組P 12 h 9 0.4829±0.0330 0.5586±0.0640 0.00024 h 9 0.5172±0.0594 0.5880±0.0153 0.01748 h 9 0.5441±0.0470 0.6003±0.0206 0.019
表中可看到,同一時間點(diǎn)內(nèi)對照組與實(shí)驗(yàn)組間行配對t檢驗(yàn),相同的時間點(diǎn)內(nèi),實(shí)驗(yàn)組的上清液羥脯氨酸量,均值均大于對照組。三組配對t檢驗(yàn),均為P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表示相同時間和細(xì)胞數(shù)的條件下,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞,分泌更多的膠原,提示細(xì)胞種植在支架材料上的三維培養(yǎng),更能促進(jìn)細(xì)胞的分泌功能。
牙周韌帶細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)是構(gòu)成牙周組織的主要細(xì)胞,在牙周組織修復(fù)過程中,PDLCs起了關(guān)鍵性的作用。但在牙周病損部位,PDLCs來源非常有限,以至于牙周組織很難達(dá)到有效的再生和重建,而組織工程技術(shù)有望解決這一難題。
生物活性玻璃作為一種新型的硬組織修復(fù)材料,具有理想的生物活性及骨重建功能。生物活性玻璃支架植入機(jī)體后最顯著的變化是富含非晶型磷酸鈣表層的形成,可選擇性地吸收血清蛋白,有利于細(xì)胞吸附的成骨細(xì)胞的表型表達(dá)[2]。聚羥基烷酸酯(PHBV)是由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的熱塑性生物聚酯,具有良好的組織相容性,作為骨移植組分,具有增強(qiáng)作用,一定時間內(nèi)可完全生物降解[3]。將二者進(jìn)行復(fù)合,制成三維立體多孔材料,既能發(fā)揮PHBV的局部正性壓電效應(yīng),刺激骨細(xì)胞的生長分化,又能發(fā)揮SGBG的骨傳導(dǎo)作用和材料三維多孔結(jié)構(gòu)的骨誘導(dǎo)作用。研究結(jié)果表明[4],羥基磷灰石多晶體可吸附粘多糖膠樣層、粘多糖、糖蛋白,從而在SGBG和骨之間形成有機(jī)-無機(jī)界面,這種結(jié)合非常穩(wěn)定,有利于新骨在BG表面的形成和生長。PHBV分子鏈的水解產(chǎn)物的排出及BG表面羥基磷灰石多晶體的形成,對于骨組織在多孔支架上形成、生長和正常的新陳代謝是非常有利的。
進(jìn)行牙周組織工程研究,首要任務(wù)之一是選擇符合牙周組織工程的支架材料。傳統(tǒng)的生物活性玻璃[5,6],由于是在1400℃左右熔化后經(jīng)一系列后續(xù)加工而成,制備工藝復(fù)雜,性能不夠穩(wěn)定。本研究所用的生物活性玻璃,是利用溶膠-凝膠法低溫制備的納米尺寸的SGBG/PHBV,具有很好的生物相容性。生物活性玻璃,應(yīng)用于單純骨組織修復(fù)的研究較多,但在牙周組織修復(fù)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)所用SGBG/PHBV,國內(nèi)未見運(yùn)用于牙周組織工程的研究報(bào)道。
細(xì)胞培養(yǎng)法是評價生物材料組織相容性的重要方法,與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比具有簡便、重復(fù)性好實(shí)驗(yàn)條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用直接接觸法,通過將體外培養(yǎng)的PDLCs接種到SGBG/PHBV三維支架上復(fù)合立體培養(yǎng),使SGBG/PHBV與牙周組織的主要功能細(xì)胞PDLCs直接接觸,檢測材料對細(xì)胞分泌功能的影響,為SGBG/PHBV構(gòu)建牙周組織工程支架的可能性提供初步的研究數(shù)據(jù)。將高密度細(xì)胞接種在具有一定空間結(jié)構(gòu),有一定孔隙率,孔徑大小,孔間交通的支架材料上,細(xì)胞在模擬體內(nèi)細(xì)胞的化學(xué),物理和生物學(xué)條件下,在三維基質(zhì)支架中進(jìn)行培養(yǎng)稱為三維培養(yǎng)[7]。細(xì)胞在三維立體的空間結(jié)構(gòu)中生長,能夠更好地增殖和行使分泌功能。PDLCs的成纖維表型分泌III型膠原,成骨細(xì)胞表型分泌I型膠原。羥脯氨酸特定地存在膠原蛋白中,而不存在于一般的蛋白質(zhì)中。測定上清液中羥脯氨酸含量,可以定量地反映細(xì)胞分泌的膠原含量,研究SGBG/PHBV對PDLCs分泌膠原功能的影響。結(jié)果表明材料對PDLCs的增殖和分泌膠原的功能不但均未見抑止作用,而且細(xì)胞三維培養(yǎng)更能促進(jìn)細(xì)胞的分泌功能。表明SGBG/PHBV和PDLCs具有良好的生物相容性,SGBG/PHBV可進(jìn)一步應(yīng)用于牙周組織工程的研究。
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