蝙蝠葛堿抑制肺癌細(xì)胞QG－56增殖的實(shí)驗(yàn)研究

石玉生，張艷，王加志，張金良

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

北豆根始載于《中國(guó)藥植志》［1］是防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC)的干燥根莖，為北方習(xí)用中藥，性味苦、寒，有清熱解毒、祛風(fēng)止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，其具有抑菌、降壓和抗心律失常等作用，常用于治療咽喉腫痛、腸炎痢疾和風(fēng)濕痹痛等癥。北豆根在治療扁桃體炎、咽喉腫痛、牙齦腫痛方面有良好的效果，用北豆根總堿制成的片劑和注射液已廣泛應(yīng)用于臨床，而關(guān)于其抗腫瘤作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。文獻(xiàn)報(bào)道，北豆根中主要化學(xué)成分為生物堿 ，其主要有效成分為蝙蝠葛酚性生物堿(phenolic alkaloids of menis permum dauricum，PAMD)，對(duì)多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的抑制作用，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用［2～4］。本課題組分離得到蝙蝠葛酚性生物堿中的主要成分蝙蝠葛堿，研究表明，其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的抑制作用，為蝙蝠葛堿作為抗癌新藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株QG－56。

1.2 腫瘤細(xì)胞株懸液制備 常規(guī)方法培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)濃度為1×105個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸液備用。

1.3 蝙蝠葛堿的制備 北豆根干品經(jīng)95%乙醇浸泡過(guò)夜，加熱回流提取3次，提取液濃縮，再以3%HCl溶解，將水相調(diào)節(jié)pH=9，過(guò)濾得到酚性總堿，再用萃取法得到純化的蝙蝠葛堿。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株QG－56細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素(100U·mL－1)、鏈霉素(100mg·mL－1)的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5%CO2以及飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)呈70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每3～4d傳代1次。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖反應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌細(xì)胞株QG－56細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL－1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含有不同蝙蝠葛堿(1.125、2.25、5.5、11、22μg·mL－1)的培養(yǎng)基，每孔200μL，并設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，向各培養(yǎng)孔加入 MTT(5mg·ml－1)10μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄去上清，每孔加入10%DMSO 150μL，振蕩器震蕩10min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度值(OD)，檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)620nm。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞抑制率。抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

蝙蝠葛堿(Dau)能有效抑制癌細(xì)胞株QG－56細(xì)胞增殖。MTT分析結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，Dau在3.125～50μg·mL－1濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，作用24h對(duì)QG－56細(xì)胞增殖的抑制率分別為(4.6±1.15)%，(12.47±2.13)%，(28.33±3.12)%，(47.25±4.13)%，(62.61±3.68)%;48h抑制率分別為(6.62±4.12)%，(22.32±2.18)%，(40.43±4.15)%，(52.34±1.68)%，(82.86±1.69)%;72h抑制率分別為(16.16±3.68)%，(32.65±2.89)%，(51.23±3.82)%，(62.35±2.63)%，(91.23±0.86)%，抑制率隨著Dau濃度的增加而增加，存在明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。不同濃度Dau之間的抑制率比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，以22μg·mL－1Dau作用72h抑制率最高(為91.23%)(Table 1)。

Table 1 Effect of Dau on proliferation of QG－56 Lung cancer cells(±s)

Table 1 Effect of Dau on proliferation of QG－56 Lung cancer cells(±s)

Dau content Treatment times(μg·mL－1) 24h(%) 48h(%) 72h(%)1.125 4.6±1.15 6.62±4.12 16.16±3.68 2.25 12.47±2.13 22.32±2.18 32.65±2.89 5.5 28.33±3.12 40.43±4.15 51.23±3.82 11 47.25±4.13 52.34±1.68 62.35±2.63 22 62.61±3.68 82.86±1.69 91.23±0.86

3 討論

總之，文獻(xiàn)對(duì)于蝙蝠葛堿的抗腫瘤作用罕有報(bào)道，僅有北豆根的有效成分之一蝙蝠葛堿的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等相關(guān)報(bào)道［5，6］。田代華著《實(shí)用中藥辭典》中，謂北豆根可用于治療消化道癌癥［7］。本文使用人腫瘤細(xì)胞株QG－56作為代表細(xì)胞株，結(jié)果表明，蝙蝠葛堿有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞株增殖反應(yīng)的作用，蝙蝠葛堿對(duì)QG－56癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。蝙蝠葛堿是生物堿類成分，有較好的脂溶性，具有易進(jìn)入細(xì)胞、體內(nèi)分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步的研究可以為北豆根在抗腫瘤方面的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)于蝙蝠葛堿的臨床應(yīng)用及對(duì)惡性腫瘤防治，提供寶貴的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:532.

［2］Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of Apoptosis by Bcl22:release of cytochrome f rom mitochondria blocked［J］.Science，1997，275(5303):1129－1132.

［3］尹蕊，蘇慧，邵成文，等.蝙蝠葛酚性堿對(duì)BXPC－3荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡基因p53表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(6):35－37.

［4］蘇云明，劉坤，章艷，等.蝙蝠葛酚性堿對(duì)BXPC－3腫瘤抑制作用及腫瘤組織中 MMP－9含量的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(1):33－34.

［5］LI Jian－h(huán)ua，QIN Feng－qi，YANG Pei－man.Reversal of multidrug resistance in human K 562/ADM cell line by dauricine［J］.Journal of Dalian Medical University，2002，24(2):94－96.

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［7］田代華.實(shí)用中藥辭典［M］.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:493－495.