葡萄糖氧化酶法篩選西洋參干預(yù)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的活性成分

葛鵬玲，李冀，馬育軒，尚廣巍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰島素抵抗(IR)是由遺傳和環(huán)境因素導(dǎo)致的機(jī)體對胰島素生理作用的反應(yīng)性降低。即胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取作用受損，導(dǎo)致代償性胰島素分泌增多，其重要標(biāo)志為高胰島素血癥［1］。主要表現(xiàn)為外周組織對胰島素敏感性下降，對葡萄糖的利用障礙［2］。

本實驗通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響，篩選西洋參干預(yù)胰島素抵抗的有效成分。從而為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制及開發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠3T3－L1前脂肪細(xì)胞株來源于American Type Culture Collection(ATCC)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心提供。

1.2 儀器與試劑

胰島素(諾和諾德公司);地塞米松(Sigma公司);異丁基—甲基—黃嘌呤(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA，澳大利亞ST1006);DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司);葡萄糖氧化酶法測定試劑盒(上海伊華生物科技有限公司);熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71);CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific);超凈工作臺(上海造鑫企業(yè)有限公司);酶標(biāo)儀(TECAN公司)。

1.3 西洋參單體成分的分離

將西洋參的根部用70%EtOH回流提取，將此提取物進(jìn)行AB－8型大孔樹脂柱色譜分析，按不同濃度洗脫，得到西洋參95%醇提組、西洋參60%醇提組、西洋參30%醇提組和水提組四個部分。前期藥效學(xué)試驗證明，西洋參60%醇提組為活性部位。再將西洋參60%醇提部位用硅膠柱色譜及HPLC等分離技術(shù)與方法分離和純化，通過理化常數(shù)及光譜數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)。共得12個化合物。

1.4 3T3－L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

培養(yǎng):3T3－L1前脂肪細(xì)胞可經(jīng)定向誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞。3T3－L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)包括培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇及誘導(dǎo)分化過程。將3T3－L1前脂肪細(xì)胞種入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10%優(yōu)級小牛血清及青、鏈霉素的高糖(25mmol·L－1glucose)DMDM培養(yǎng)液4～5mL，置37℃細(xì)胞孵育箱中，5%CO2條件下培養(yǎng)，每2d換1次培養(yǎng)液。每天觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞生長至80%滿后進(jìn)行傳代或凍存。

分化:3T3－L1前脂肪細(xì)胞生長至接觸抑制，待細(xì)胞匯合2天后加0.05mmol·L－13－異丁基－1－甲基黃嘌呤(IBMX)，1mmol·L－1地塞米松，10mg·L－1胰島素和10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，10mg·L－1胰島素和10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，2d換1次培養(yǎng)液，8～12d細(xì)胞90%以上呈成熟脂肪細(xì)胞表形。

1.5 葡萄糖氧化酶法測培養(yǎng)基中葡萄糖濃度

1瓶葡萄糖工作試劑加100mL ddH2O，振蕩混勻;96孔板中每孔取8μL培養(yǎng)液，加入含1mL工作試劑的試管中，振蕩混勻，另取標(biāo)準(zhǔn)液8μL，加入含1mL工作試劑的試管中;37℃水浴20min;每試管取100μL混合液，加入96孔酶標(biāo)板中;酶標(biāo)儀在510nm處測吸光光度值(OD值);根據(jù)公式計算待測液葡萄糖濃度。待測葡萄糖濃度(mmol·L－1)=待測液OD值/標(biāo)準(zhǔn)液 OD 值 ×5.5mmol·L－1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)

光鏡下3T3－L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，呈長梭型，細(xì)胞內(nèi)沒有脂肪積聚，誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)變圓，胞漿出現(xiàn)脂滴，隨著分化程度的加深，脂滴積聚增多。誘導(dǎo)分化8d后，90%以上呈成熟脂肪細(xì)胞表形，胞漿內(nèi)有大量的脂滴，如圖1所示。

圖1 脂肪細(xì)胞

2.2 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立及鑒定

將24孔培養(yǎng)板中分化成熟的脂肪細(xì)胞，以含1%BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，分為正常葡萄糖正常胰島素組(5.5mmol·L－1葡萄糖，1×10－9mol·L－1胰島素)及高葡萄糖高胰島素組(25mmol·L－1葡萄糖，1 ×10－6mol·L－1胰島素)，每組7個樣本。干預(yù)24h后，通過葡萄糖消耗試驗測定兩組脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的情況。

表1 高糖高胰島素對葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

表1 高糖高胰島素對葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

注:與正常組比較，★P<0.01;RG－葡萄糖剩余量，CG－葡萄糖消耗量。

2.70±0.15 2.80±0.15高糖高胰島素組 4.21±0.22★ 1.29±0.22正常組★

如表1所示，與正常葡萄糖正常胰島素組葡萄糖消耗量比較，高葡萄糖高胰島素組葡萄糖消耗量明顯下降，差異極顯著(P<0.01)，說明應(yīng)用此法可建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。

2.3 西洋參單體成分對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響

實驗分為空白對照組、模型組、西洋參單體成分組(12)及羅格列酮組。干預(yù)培養(yǎng)24h后，通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響，篩選西洋參干預(yù)胰島素抵抗的活性成分。

表2 藥物對IR細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

表2 藥物對IR細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

注:與模型組比較，☆P<0.05，★P<0.01。

2.72±0.17 2.78±0.17模型組 4.10±0.22 1.40±0.22羅格列酮組 3.24±0.25★ 2.26±0.25★人參皂苷R3組 3.25±0.10★ 2.25±0.10★20(R)人參皂苷Rb1組 3.56±0.12★ 1.94±0.12★20(R)人參皂苷Rb2組 3.61±0.15★ 1.89±0.15★擬人氏皂苷F11組 1.36±0.11☆ 1.73±0.11空白組☆

實驗結(jié)果如表2所示，與模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量比較，羅格列酮組、人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、擬人參皂苷F11組細(xì)胞葡萄糖消耗量有不同程度的升高，其中人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、羅格列酮組葡萄糖消耗量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)，擬人參皂苷F11組差異顯著(P<0.05)。其余化合物組與模型組比較，葡萄糖消耗量無統(tǒng)計學(xué)差異。提示，20(R)人參皂苷 Rb1，20(R)人參皂苷 Rb2，人參皂苷R3，擬人參皂苷F11可能為西洋參干預(yù)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的活性成分。

3 討論

細(xì)胞模型相對于動物模型具有重復(fù)性好、造模周期短、外界影響因素易于控制的優(yōu)點。建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型，不僅廣泛應(yīng)用細(xì)胞水平研究胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制，尤其適用于改善胰島素抵抗藥物的篩選及其機(jī)制研究。

1988年，Reaven［3］提出的胰島素抵抗定義為胰島素靶細(xì)胞對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取及利用的抵抗，它反映的是胰島素的糖代謝效應(yīng)。在細(xì)胞實驗中，對胰島素敏感性的評價主要采用胰島素刺激下對同位素標(biāo)記的脫氧葡萄糖的攝取。但此法成本高、毒害作用大。葡萄糖氧化酶法測定脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量，相對污染小、經(jīng)濟(jì)方便、優(yōu)越性明顯，可作為評價胰島素敏感性的良好手段。

本實驗通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細(xì)胞模型葡萄糖消耗量的影響，與模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量比較，羅格列酮組、人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、擬人參皂苷F11組細(xì)胞葡萄糖消耗量有不同程度的升高，20(R)人參皂苷 Rb1，20(R)人參皂苷 Rb2，人參皂苷R3，擬人參皂苷F11可能是西洋參干預(yù)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的活性成分。

［1］李冀，馬育軒，高彥宇，等.中醫(yī)藥對2型糖尿病胰島素抵抗的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2009，26(3):5－7.

［2］李冀，馬育軒，葛鵬玲，等.西洋參治療胰島素抵抗大鼠活性部位對骨骼肌轉(zhuǎn)運蛋白－4mRNA表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2009，37(5):9－11.

［3］Reaven GM.Role of insulin resistance in human diseases［J］.Diabetes，1988，37(12):1595－1607.