實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)禽白血病病毒方法的建立與應(yīng)用

張?zhí)?凌宗帥,史玉穎,高小博,田國(guó)寧,張金玲,韓 亮,張麗萍

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濰坊261041; 2.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 濟(jì)南250010;3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,山東濟(jì)南250023; 4.北京盈九思科技發(fā)展有限公司,北京朝陽(yáng)100029)

禽白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病病毒和肉瘤病毒群中的病毒引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。根據(jù)在不同遺傳型雞胚成纖維細(xì)胞上的宿主范圍、與相同或不同亞群成員的干擾模式以及病毒囊膜抗原分為 A、B、C、D、E和 J6個(gè)亞群。該病具有水平傳播和垂直傳播兩種特性,并以垂直傳播為主,且還存在內(nèi)源性病毒[1-2]。熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性好、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),在病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。本文針對(duì)ALV的保守序列LTR設(shè)計(jì)引物和探針,建立了ALV的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)方法,為快速診斷和監(jiān)測(cè)禽白血病提供了一種新的快速有力的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 1 材料 病毒材料為實(shí)驗(yàn)室保存的2002年～2008年分離的不同的ALV毒株,分別為 ALV-1-2002,ALV-3-2003,ALV-1-2005,ALV-4-2008。用于特異性分析的新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性囊病病毒(IBD)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)和馬立克病病毒(MDV)均由實(shí)驗(yàn)室保存,Taq DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,pEASY-T載體購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司,T rizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,ALV抗原ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。

1.1.2 儀器 美國(guó)ABI公司的7500型熒光定量PCR儀、德國(guó) EPPENDORF公司5810R、5417冷凍離心機(jī)、法國(guó)VILBER公司的凝膠成像系統(tǒng)、德國(guó)EPPENDORF公司的蛋白核酸分析系統(tǒng)等。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì) 選取ALV病毒的LT R序列,利用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針序列如下:

引物 ALV-F1:5′-AGACCAAATAAGGAAAAAGCAAGA-3′;

引物 ALV-R1:5′-ATAATCGTACATAGCT T CGTCTAC-3′;

探針 :5′-CGTCAT TCCTTCCTTATCTAGTCGC CAC-3′

探針的5′端標(biāo)記 FAM 熒光基團(tuán),3′端標(biāo)記BHQ-1,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的制備 本試驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有ALV LTR序列的質(zhì)粒。將引物ALV-F1和ALV-R1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到載體pEASY-T上,采用PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆,然后再進(jìn)行測(cè)序,命名為pEASY-ALV。然后將經(jīng)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆用 LB培養(yǎng)基(含100μ g/mL氨芐青霉素)增殖[3],采用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA。用核酸分析儀測(cè)定質(zhì)粒DNA的OD260,按照文獻(xiàn)[4]方法計(jì)算其拷貝數(shù),作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品。

1.4 組織RNA的提取 取雞的腎、脾、腦等組織,混合再進(jìn)行勻漿,采用Invitrogen公司的T rizol提取核酸,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒RNA的提取。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng) 5 μ L 5×RTPCR mix(包含Taq DNA polymerase,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,dNTPs和MgCl2等 RT-PCR反應(yīng)成分),0.25 μ mol/L ALV-F1,0.25 μ mol/L ALV-R1,0.25 μ mol/L 探針和 ALV 模板 ,補(bǔ)充水至 25 μ L。PCR反應(yīng)參數(shù)如下:42℃30 min,95℃10 min,95℃10 s,60℃1 min,在60℃采集熒光,進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。

1.6 ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度和特異性 ALV質(zhì)粒 DNA以3.0×102～3.0×107系列稀釋,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。測(cè)定該方法的檢測(cè)靈敏度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別提取ALV不同分離株、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒、馬立克病病毒的核酸,測(cè)定該方法的特異性。

1.7 數(shù)據(jù)分析 熒光RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后,利用SDS 1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出待檢樣品中的病毒含量。

1.8 臨床樣品的檢測(cè) 送檢的90個(gè)有生長(zhǎng)發(fā)育不良,胸腺、腔上囊萎縮等臨床癥狀的雞的泄殖腔棉拭子樣品,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法和ELISA抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 定量PCR反應(yīng)檢測(cè)ALV的靈敏度試驗(yàn) 將質(zhì)粒pESAY-ALV的進(jìn)行10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行,進(jìn)行 ALV實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR檢測(cè)。圖1 A表示質(zhì)粒pEASY-ALV各個(gè)稀釋度的擴(kuò)增曲線。其中 X軸代表PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù),Y軸Rn代表熒光信號(hào)強(qiáng)度?？梢钥闯?質(zhì)粒濃度為3.0×102～3.0×107個(gè)拷貝6個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)定量 RT-PCR有“S”型擴(kuò)增曲線,即反映了PCR的指數(shù)增長(zhǎng)期,線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期3個(gè)階段。進(jìn)一步分析擴(kuò)增曲線,發(fā)現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線平行,反映了PCR的擴(kuò)增效率相近;而不同稀釋度之間的Ct相差均勻,符合定量PCR的Ct值與起始拷貝數(shù)之間嚴(yán)格的線性關(guān)系。每個(gè)稀釋度的兩個(gè)重復(fù),其擴(kuò)增曲線基本吻合在一起,反映了試驗(yàn)的平行性好。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值的相關(guān)性,由SDS2.1軟件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖1 B。橫坐標(biāo)代表質(zhì)?？截悢?shù)(X),縱坐標(biāo)為 Ct值。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=3.12X+39.6,相關(guān)系數(shù)R2=0.997。標(biāo)準(zhǔn)曲線在3.0×107～3.0×102拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測(cè)下限為30個(gè)拷貝。

2.2 ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn) 提取 ALV不同分離株以及新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒的核酸,進(jìn)行ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)其特異性,擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2?？梢钥闯?ALV不同分離株擴(kuò)增曲線呈“S”型,而新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性囊病病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒的沒(méi)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線,表明沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果顯示建立的ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有很好的特異性。

圖1 ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的靈敏度檢測(cè)圖

圖2 ALV特異性試驗(yàn)的熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增曲線圖

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)待檢樣品中的ALV 用建立的定量RT-PCR反應(yīng)方法檢測(cè)90個(gè)待檢的雞的泄殖腔棉拭子樣品。在檢測(cè)過(guò)程中,以ALV RNA、健康雞組織RNA為模板,分別作為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。定量PCR結(jié)果表明,陽(yáng)性對(duì)照有“S”型擴(kuò)增曲線,空白對(duì)照和陰性對(duì)照無(wú)明顯的“S”型擴(kuò)增曲線,且熒光信號(hào)值低。表明試驗(yàn)過(guò)程符合質(zhì)量控制的要求,可以排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),有56個(gè)雞的泄殖腔棉拭子樣品有“S”型擴(kuò)增曲線,且熒光信號(hào)值高,可判斷其含有ALV病毒,擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3,檢出率為 56/90,而ELISA方法檢出率為51/90,二者結(jié)果基本吻合。

3 討論

圖3 臨床樣本中ALV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增曲線圖

禽白血病給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,特別是對(duì)蛋種雞等的影響巨大,淘汰率很高。目前本病沒(méi)有有效的治療辦法和有效的藥物和疫苗預(yù)防。因此建立快速、特異和高通量的檢測(cè)方法是預(yù)防和控制本病首要之選[5-6]。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)禽白血病的方法,特異性好,只從禽白血病陽(yáng)性病料中檢測(cè)到特異性的擴(kuò)增信號(hào),不與檢測(cè)的其他常見(jiàn)家禽傳染病發(fā)生特異性反應(yīng);對(duì)禽白血病的檢測(cè)靈敏度為30個(gè)拷貝/反應(yīng),靈敏度高;檢測(cè)量大,一次可以檢測(cè)90份樣品,整個(gè)反應(yīng)都在密閉的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行,避免了樣品間的污染;檢測(cè)速度快,從樣品處理包括RNA的提取,PCR等到試驗(yàn)結(jié)束,大約需要4個(gè)小時(shí)的時(shí)間,比其他的血清學(xué)檢測(cè)方法節(jié)省了時(shí)間;準(zhǔn)確性高,Taq Man探針只與特異性的模板發(fā)生反應(yīng),假陽(yáng)性率低,與Sybr Green染料相比,不需要考慮引物二聚體和其他非特異性擴(kuò)增[7-8]。

本文結(jié)合ABI 7500熒光檢測(cè)系統(tǒng),建立了Taq Man探針實(shí)時(shí)定量RT-PCR法快速、準(zhǔn)確檢測(cè)家禽中的ALV。反應(yīng)體系包括一對(duì)引物和一條探針(長(zhǎng)度為都為19 bp),探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán),3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí),兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近,5′端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光被3′端淬滅基團(tuán)淬滅,故體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的產(chǎn)生。在PCR退火和延伸過(guò)程中,探針與模板特異性結(jié)合,隨著引物的延伸,Taq DNA聚合酶利用其5′-3′端外切酶活性,對(duì)探針進(jìn)行切割,報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán),報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被檢測(cè),熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系,可以達(dá)到定量檢測(cè)的目的。

本文建立的ALV的檢測(cè)體系中,引物和探針只與ALV核酸特異性地結(jié)合,與其他的家禽傳染病的核酸都沒(méi)有反應(yīng),表明引物和探針的特異性較好。標(biāo)準(zhǔn)曲線在3.0×102～3.0×107拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測(cè)下限為30個(gè)拷貝。定量PCR僅需要2 h操作,一次可以進(jìn)行96個(gè)樣品的檢測(cè),PCR反應(yīng)結(jié)束后可立即觀察結(jié)果,不需要電泳、染色,因此更方便、快速。

本研究建立的方法不僅克服了禽白血病病毒分離的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn),減少了檢測(cè)時(shí)間,節(jié)省了大量的人力和財(cái)力。不僅能用于養(yǎng)殖場(chǎng)中禽白血病的快速檢測(cè),為雞場(chǎng)減少損失,而且還可以用于家禽和禽肉產(chǎn)品中禽白血病的快速檢測(cè),為進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫提供可靠的檢測(cè)方法。

[1]Saif Y M.禽病學(xué)[M].蘇敬良,高福,索勛,譯.11版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005.

[2]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[3]薩姆布魯克 J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.2版.北京:科學(xué)出版社,1999.

[4]Giulietti A,Overbergh L,Valckx D,et al.An overview of realtime quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods,2001,25:386-401.

[5]崔治中,張志,杜巖.我國(guó)肉用型雞群中J亞型白血病流行現(xiàn)狀的調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,24(4):292-294.

[6]成子強(qiáng),趙振華,郝永清,等.禽白血病病毒J亞群(ALV-J)的血清學(xué)調(diào)查及PCR診斷[J].中國(guó)病毒學(xué),2002,17(4):324-329.

[7]Brownie J,Shawcross S,Theaker J,et al.T he elimination of primer-dimer accumulation in PCR[J].Nucleic Acids Res,1997,25:3235-3241.

[8]Halford W P,Falco V C,Gebhardt B M,et al.T he inherent quantitative capacity of the reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Anal Biochem,1999,266:181-191.