豬肺炎支原體基因組學(xué)研究進(jìn)展

祝永琴,劉茂軍,邵國青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京210095)

一個(gè)生物的全部DNA序列稱作該生物的基因組(geneome),基因(gene)是基因組中有關(guān)蛋白質(zhì)遺傳信息的編碼單位?；蚪M學(xué)是關(guān)于基因組結(jié)構(gòu)、基因功能以及基因組比較的一門科學(xué)。支原體(Mycoplasma)由于基因組比較小,是屬于最早被進(jìn)行基因組測(cè)序的微生物物種之一。1995年10月,人類完成了第一個(gè)原核生物,即生殖支原體G37株的基因組測(cè)序。目前已完成了17株支原體基因組測(cè)序。本文主要介紹一下豬肺炎支原體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1 豬肺炎支原體

豬肺炎支原體(Mhp),是引起豬支原體肺炎(MPS)的主要病原體。該病以接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)[1],主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難,其主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻和飼料轉(zhuǎn)化率嚴(yán)重下降,而且很容易繼發(fā)其他病原的感染,誘導(dǎo)形成慢性肺炎。本病流行范圍廣,且難以治愈,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,是世界上最主要的豬病之一[2]。目前,已經(jīng)完成3株豬肺炎支原體的基因組測(cè)序,它們是7448型,J株以及232型。

2 豬肺炎支原體基因組結(jié)構(gòu)

2.1 一般特征 豬肺炎支原體232型基因組892 758 bp,平均G+C含量 28.6%,推測(cè)有692個(gè)CDS(編碼序列),編碼的蛋白質(zhì)大小平均約388個(gè)氨基酸。692個(gè)CDS中,304個(gè)編碼具有功能作用的蛋白(約44%),261個(gè)編碼保守的假定蛋白,127個(gè)編碼特征性假定蛋白[3]。其基因組中有一個(gè)獨(dú)立的16S-23S rRNA操縱子基因,一個(gè)5S rRNA,它位于距離23S rRNA基因100 kb處,還有30個(gè)tRNA編碼基因。基因組中含有很多基因家族,占總編碼序列的26.3%。豬肺炎支原體7448型以及J株的基因組特點(diǎn)與232型有一定的差異,它們的基因組特點(diǎn)見表1[4]。

表1 豬肺炎支原體7448型以及J株基因組一般特征

2.2 基因組結(jié)構(gòu) 與其他支原體不同,豬肺炎支原體中幾乎不存在重復(fù)序列,但是其粘附因子P97中存在重復(fù)序列,同時(shí)P97操縱元下游的P102蛋白中也存在重復(fù)序列。啟動(dòng)子下游310 bp處可能編碼脂蛋白的mhp288中也存在 10.6個(gè)重復(fù)序列(CTACCCAAAAAGATCAAA)。豬肺炎支原體重復(fù)序列的分析結(jié)果顯示,它的最小長(zhǎng)度為25 bp,出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)序列是反向互補(bǔ)的。

2.3 復(fù)制起始區(qū) 豬肺炎支原體rpmH和dnaA基因間存在長(zhǎng)348 bp的基因間區(qū)域,dnaA和dnaN基因間存在長(zhǎng)148 bp的基因間區(qū)域。這些基因間區(qū)域內(nèi)存在T TATC(C,A)A(C,A)編碼的dnaA盒[5],在dnaA上游基因間區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)DnaA盒,而在dnaA和dnaN之間的區(qū)域內(nèi)沒有DnaA盒。豬肺炎支原體基因組中分散總共存在著688個(gè)這種基序。

2.4 P97和P102基因家族 由于支原體的基因組比較短,所以它的基因必須具有高度編碼能力,這樣才能使其具有一些必須功能。用BLASTCLUST分析,如果至少70%長(zhǎng)度中有30%的氨基酸相似則定義為基因家族。豬肺炎支原體能夠粘附到豬呼吸道上皮黏膜纖毛上,是由于纖毛上存在Mhp粘附因子P97的特異性受體,而且基因分析表明,P97操縱元內(nèi)還存在一個(gè)編碼126 kDa的蛋白[6],命名為P102,這個(gè)蛋白的功能目前尚不清楚。對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行BLASTP分析表明,P97和P102基因都存在基因家族。

2.5 脂蛋白 脂蛋白是支原體膜表面的主要成分[8],它們可能與支原體抗原變異性有關(guān),而且可能是其功能結(jié)構(gòu)。對(duì)豬肺炎支原體基因組進(jìn)行基序分析,其上有53個(gè)ORFs可以與原核脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)結(jié)合,這表明其基因組編碼容量為8.5%,其中只有3個(gè)ORFs(psgA,trsE以及ushA)具有功能,對(duì)于P46 ORF[9]和P65 ORF[10]前面都已經(jīng)研究過了。P65(mhp677)在蛋白質(zhì)水平上有兩個(gè)同源序列mhp539和mhp069。P46蛋白是一種具有種特異性的 Mhp膜蛋白。Futo[11]報(bào)道,P46基因(1257bp)中含有 3個(gè) TGA和1個(gè)CGG密碼子。并且至少有1個(gè) TGA編碼色氨酸[12],而 TGA在通用密碼子中為終止密碼子,CGG與通用密碼子一致編碼精氨酸[13]。P46基因前面沒有-35區(qū),這是Mhp所特有的。P65蛋白是一種脂蛋白,也是Mhp的主要免疫原蛋白,其免疫原區(qū)位于C端[14],它具有種特異性表位。

2.6 運(yùn)輸?shù)鞍?豬肺炎支原體有一個(gè)蛋白質(zhì)家族具有磷酸轉(zhuǎn)移酶基序,包括sgaA(mhp386),sgaB(mhp387),sgaT(mhp571),mtlF(mhp567),mtlA(mhp569),nagE(mhp590)和licA(mhp042)等閱讀框。2.7 DNA復(fù)制和修復(fù)反應(yīng) 豬肺炎支原體DNA聚合酶Ⅲ主要有α亞單位(polC,mhp549),α亞單位 2(dnaE,mhp599),β 亞單位(dnaN,mhp002),γtau亞單位(dnaX,mhp123),以及一個(gè)附加亞單位(mhp119),該亞單位是保守的,對(duì)其功能目前還不清楚。目前,已經(jīng)知道m(xù)hp598閱讀框具有DNA聚合酶I上的3′-5′核酸外切酶部分,但是豬肺炎支原體上沒有RNase H基因,因此目前還不清楚DNA復(fù)制過程中的岡崎片段是怎么移動(dòng)的?豬肺炎支原體上的 DNA解旋酶[15],是由亞單位 A(gyrA,mhp545)和亞單位B(gyrB,mhp270)構(gòu)成的。其引發(fā)體的成分主要有dnaG引發(fā)酶(mhp062)以及dna C脫氧核糖核酸解螺旋酶(mhp664)。

其基因組中有編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因,這樣可以舒緩超級(jí)螺旋的張力。拓?fù)洚悩?gòu)酶包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topA,mhp097)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的成分有亞單位A(parC,mhp034)和B(parE,mhp035)。另外,和其他支原體一樣,豬肺炎支原體具有初級(jí)DNA修復(fù)和應(yīng)激系統(tǒng)。

2.8 毒力因子 目前對(duì)豬肺炎支原體的毒力因子研究還不是特別清楚,但是P97作為粘附因子的功能已經(jīng)確定。依賴基序分析來預(yù)測(cè)潛在的毒力因子是一種必然趨勢(shì),同時(shí)通過研究其他支原體和細(xì)菌的毒力因子來預(yù)測(cè)豬肺炎支原體的毒力因子也是一種策略,革蘭陽性菌的毒力與蛋白酶有關(guān),豬肺炎支原體有5種帶有氨基肽酶標(biāo)記的蛋白質(zhì),分別為(map[mhp209], pepA [mhp462],pepF[mhp520],pepP[mhp680]和 gcp[mhp656]),并且有兩種帶有絲氨酸蛋白酶標(biāo)記的蛋白質(zhì),分別為(mhp287和 mhp292),還有一個(gè) ClpB同系物(mhp278)。現(xiàn)在認(rèn)為其中一種或者多種蛋白酶參與纖毛粘附因子P97的翻譯后加工[16]。P97蛋白的氨基酸序列中只有一段疏水區(qū),即位于N末端的由17個(gè)氨基酸組成的疏水區(qū),是潛在的跨膜區(qū),主要的抗原區(qū)分布在C末端附近。在814～887個(gè)氨基酸(核酸序列的2 440～2 665)處有一段由5個(gè)氨基酸(V/EAAKP)組成的15個(gè)重復(fù)序列,即R1重復(fù)區(qū)。此外在靠近C末端的981～1 020個(gè)氨基酸(核酸序列的2 941～3 061)處有一段由10個(gè)氨基酸(GTPNQ GKKAE)組成的4個(gè)重復(fù),即 R2重復(fù)區(qū)。

2.9 基因調(diào)節(jié) 和其他支原體一樣,豬肺炎支原體幾乎沒有控制基因表達(dá)的途徑。其基因組內(nèi)只有單個(gè)δ因子(rpoD,mhp063),沒有PROSITE araC,lysR,gntR,luxR和δ 54作用區(qū)域。在人型支原體,發(fā)酵支原體和關(guān)節(jié)炎支原體研究中發(fā)現(xiàn),一些短的腺嘌呤和胸腺嘧啶同聚束參與其脂蛋白位相轉(zhuǎn)化過程[17]。豬肺炎支原體和其他9種已測(cè)序的支原體中都有DnaK-DnaJ-GrpE伴侶分子復(fù)合物的成員,這些組分具有控制新生多肽鏈折疊的作用。豬肺炎支原體缺失了 Hsp60(GroEL)[18],對(duì)已報(bào)道序列(AJ251765)進(jìn)行BLAST分析后更加證實(shí)了該結(jié)論,同時(shí)它還缺失了GroES,這表明其胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)折疊以及對(duì)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)的修復(fù)過程都是由DnaK-DnaJ-GrpR復(fù)合物完成的。mhp234(二硫鍵伴侶分子家族HSP33的成員之一);mhp278(具有伴侶蛋白活性的和 clpAB 2的 ATPase),以及mhp554,mhp656和mhp673(金屬依賴蛋白酶和假定分子伴侶)等都是假定伴侶分子。

豬肺炎支原體是第10個(gè)完成測(cè)序的支原體目成員,而且是惟一1個(gè)豬的支原體。從種系發(fā)育史上可以知道,它和肺支原體的關(guān)系最近,肺支原體是一種侵蝕性抗原。由于支原體目成員具有高度的趨異性,并且缺乏同線型,所以阻礙了對(duì)它們進(jìn)行直接的比較研究,但是肺炎支原體和生殖支原體是例外,它們具有高度的相關(guān)性[19]。

總之,本文主要陳述了豬肺炎支原體基因組的一般特征,并且對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析,為研究豬肺炎支原體的粘附機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ),從而促進(jìn)對(duì)豬支原體肺炎的研究。

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