六神丸抗腫瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究

孫莉

新生血管既是惡性腫瘤快速增長(zhǎng)所必須的先決條件，亦是惡性腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要步驟和渠道，以腫瘤血管形成為靶點(diǎn)的抗轉(zhuǎn)移研究己成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)，阻斷腫瘤血液輸送，防治腫瘤新生血管形成的血管生成抑制劑為抗腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移藥物研究提供了新的方向。六神丸是臨床治療腫瘤的有效復(fù)方，本實(shí)驗(yàn)選擇六神丸作為研究對(duì)象，擬研究其在腫瘤新生血管的生成中作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 MCF-7人乳腺癌瘤株，購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室。

1.2 主要試劑及試劑盒 鼠抗人VEGF單克隆抗體(北京岳泰生物公司)，鼠抗人MMP-9單克隆抗體(北京岳泰生物公司)。

1.3 動(dòng)物含藥血清制備及實(shí)驗(yàn)分組 Wistar大鼠20只，雄性，體重(200±20)g。隨機(jī)分為空白血清組(對(duì)照組)8只，含藥血清制備組12只。含藥血清組每日給予六神丸溶液(5 mg/ml)3ml/次，2次/d灌胃，空白血清組每日給予等量生理鹽水灌胃，于給藥第3天，于末次灌藥前12 h禁食，末次給藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃、30 min滅活處理，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，分裝入小瓶，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)分組，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組情況

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，接種于50 ml培養(yǎng)瓶，加入DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清，青、鏈霉素各100 u/ml)8 ml，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。至細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后，去掉原培養(yǎng)液，分別加入以上各對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組含藥血清，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，制備單細(xì)胞懸液，加入鼠抗人VEGF單克隆抗體或鼠抗人MMP-9單克隆抗體，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 六神丸對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的VEGF表達(dá)的影響，見表2。

表2 六神丸對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的VEGF熒光表達(dá)強(qiáng)度的影響

從上表可以得出:對(duì)照組(10%正常鼠血清組)及各處理組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，各處理組VEGF熒光表達(dá)強(qiáng)度水平均有所下降，六神丸含藥血清組下降明顯，20%含藥鼠血清組較10%含藥鼠血清組更為明顯;DDP+10%正常鼠血清組較之對(duì)照組也有明顯下降，但不及六神丸含藥鼠血清組;DDP+10%含藥鼠血清組的熒光表達(dá)強(qiáng)度最低。VEGF熒光表達(dá)圖顯示:對(duì)照組的VEGF熒光表達(dá)強(qiáng)度波峰顯著右移，熒光強(qiáng)度高，經(jīng)各含藥血清作用后，VEGF的熒光表達(dá)強(qiáng)度波峰顯著左移，DDP+10%含藥鼠血清組波峰左移最為明顯，熒光強(qiáng)度值顯著下降。

2.2 六神丸對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的MMP-9表達(dá)的影響，見表3。

表3 六神丸對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的MMP-9熒光表達(dá)水平的影響

從上表可以得出:對(duì)照組(10%正常鼠血清組)及各處理組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，各處理組MMP-9熒光表達(dá)強(qiáng)度水平均有所下降;六神丸含藥血清組下降明顯，20%含藥鼠血清組較10%含藥鼠血清組更為明顯;DDP+10%正常鼠血清組熒光表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯下降，但不及10%及20%含藥鼠血清組下降明顯;DDP+10%含藥鼠血清組的熒光表達(dá)強(qiáng)度最低。熒光表達(dá)圖顯示:對(duì)照組的MMP-9熒光表達(dá)強(qiáng)度波峰顯著右移，熒光強(qiáng)度高，經(jīng)各含藥血清作用后，MMP-9的熒光表達(dá)強(qiáng)度波峰顯著左移，DDP+10%含藥鼠血清組波峰左移最為明顯，熒光強(qiáng)度值顯著下降。

結(jié)果表明:各處理組VEGF及MMP-9熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，與正常鼠血清組比較差異顯著;六神丸含藥鼠血清對(duì)MCF-7細(xì)胞VEGF及MMP-9熒光表達(dá)有明顯抑制作用，且隨藥血清濃度升高抑制作用增強(qiáng);DDP+10%含藥鼠血清組的抑制作用最強(qiáng)，說明含藥鼠血清與DDP合用有增效作用。

3 結(jié)論

正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞是穩(wěn)定的，當(dāng)受到生理或病理的刺激如創(chuàng)傷、缺氧或腫瘤生長(zhǎng)時(shí)開始增生以形成新的血管。新生血管形成包括毛細(xì)血管內(nèi)皮層下基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列過程。腫瘤血管生成必須依賴于瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及周圍宿主細(xì)胞分泌相關(guān)的血管生成活性因子誘導(dǎo)刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，導(dǎo)致血管新生。新血管的形成、發(fā)展及調(diào)節(jié)取決于血管生成促進(jìn)因子(正調(diào)節(jié))和血管生成抑制因子(負(fù)調(diào)節(jié))之間的平衡。當(dāng)促進(jìn)血管生成的正調(diào)節(jié)因子占優(yōu)勢(shì)時(shí)，就導(dǎo)致血管增生，反之就被抑制。在正常組織中，血管形成是受到嚴(yán)格調(diào)控的，由于血管新生的正負(fù)調(diào)節(jié)因子處于平衡狀態(tài)，即促血管生長(zhǎng)因子被高水平的血管生成抑制因子嚴(yán)格控制，血管生成的開關(guān)處于關(guān)閉狀態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞維持穩(wěn)定。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管形成是通過改變血管生成因子和血管抑制因子之間的平衡來實(shí)現(xiàn)的。一旦平衡遭到破壞，導(dǎo)致腫瘤組織中生長(zhǎng)因子過度表達(dá)，抑制因子表達(dá)過低，腫瘤血管生成的開關(guān)將被打開，使得腫瘤組織完全傾向于血管生成一方，最終導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，也是目前己知作用最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)中起骨架作用的主要成分，在腫瘤介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用。因此，MMP-9與VEGF協(xié)同表達(dá)可作為血管生成與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)以流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定 MCF-7細(xì)胞 VEGF、MMP-9表達(dá)。結(jié)果顯示，六神丸含藥鼠血清能顯著抑制VEGF、MMP-9的表達(dá)，高濃度的鼠藥血清優(yōu)于低濃度血清組，DDP單用能顯著下調(diào)VEGF、MMP-9表達(dá)，但不及六神丸鼠藥血清組，而DDP+10%六神丸鼠藥血清組抑制作用最明顯。六神丸是攻毒法的代表方劑，是臨床治療腫瘤的有效復(fù)方。選擇六神丸作為研究對(duì)象，從抗腫瘤血管生成方面立意，探討其抗腫瘤作用的機(jī)理，豐富了六神丸在腫瘤治療中的內(nèi)涵，對(duì)腫瘤的臨床治療有重要的指導(dǎo)意義。