野馬追對急性油酸性肺損傷大鼠肺血管通透性的影響

楊 輝，周遠大，何海霞

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床藥理教研室，重慶 400016）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素引起的彌漫性肺泡-毛細血管膜炎癥性損傷，嚴重的ALI被定義為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ALI的主要機制在于微血管通透性增高引起的蛋白泄漏、中性粒細胞聚集和促炎性介質(zhì)的表達，目前尚無非常有效的藥物。野馬追盛產(chǎn)于江蘇、安徽等地山區(qū)，其他各省也有分布，藥源豐富。野馬追具有明顯的鎮(zhèn)咳、平喘和祛痰作用[1]，對大鼠急性肺損傷具有明顯的保護作用[2]。本試驗研究了野馬追對急性油酸性肺損傷大鼠肺血管通透性的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

健康合格清潔級Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重220～280 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。油酸（蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院）；野馬追提取液，棕黑色液體，味苦澀，每1 mL原液含1.28 g藥材，江蘇安格藥業(yè)有限公司，批號為003086，密閉放置于4℃冰箱中保存，試驗前先用煮沸法將其濃縮配制成每1 mL含2.56 g生藥的野馬追提取液，臨用時再用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度；伊文思藍（EBD，上?？婆d生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物模型的建立、分組及給藥方法

將動物隨機分為空白對照組（A組），模型對照組（B組），地塞米松組（C組），野馬追大劑量組（D1組）、中劑量組（D2組）和小劑量組（D3組），每組12只。除A組外的其余各組動物分別靜脈注射以0.1%牛血清白蛋白（BSA）振蕩混勻的油酸0.1 mL/kg，A組靜脈注射等容量的BSA，造成肺損傷模型，造模6 h后采集相關(guān)試驗樣本。D1組、D2組、D3組分別按 22，11，6 g/kg 劑量灌服野馬追提取液[1]，給藥容積為每100 g體重2 mL，A組、B組及C組灌服等容量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。于末次灌服藥物后，C組予腹腔注射地塞米松2 mg/kg，其余各組給予相同容量的生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 病理學檢查

各組任意取2只大鼠，切除右肺中葉（自肺門至肺邊緣一段），用福爾馬林固定后作形態(tài)學觀察。

1.2.3 觀察指標及測定方法

支氣管-肺泡灌洗液（BALF）分析：各組取10只大鼠，分離氣管，于環(huán)狀軟骨下方用手術(shù)刀片做倒T型切口（取材時避免血液進入氣管，以免影響灌洗液的成分），將自制的塑料軟管插入氣管，用縫合線固定（避免漏氣），分離心肺（不要觸及肺臟以免影響灌洗），結(jié)扎右側(cè)支氣管。切除右肺中葉（自肺門至肺邊緣一段），用作肺血管通透性測定。用注射器分別抽取3，2，2 mL生理鹽水，緩慢注入左肺中再緩慢吸出，連續(xù)3次，總量為5 mL，要求回收率大于75%（必要時用紗布輕柔擠壓肺組織）。取BALF，將離心后沉降的細胞用 500 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）重新懸起，取 100 μL細胞懸液用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。采用Lowry法[3]測定BALF中蛋白含量，計算肺通透指數(shù)。肺通透指數(shù)=BALF中蛋白含量/血漿蛋白含量。

肺血管通透性測定[4-5]：先描繪EBD的甲酰胺溶液的標準曲線。各組取10只大鼠，均在取樣前15 min從尾靜脈注射EBD 30 mg/kg，開胸取肺，以濾紙吸干表面水分，剪去周圍組織，將肺浸泡于甲酰胺溶液中（甲酰胺用量為每100 g體重20 mL），置37℃溫箱中溫育72 h，取出肺組織，離心，取上清液，用UVmini 1240型紫外-可見分光光度儀進行比色，根據(jù)標準曲線計算每克肺組織中EBD含量，以反映肺血管通透性變化。

肺系數(shù)及肺含水量測定：試驗結(jié)束后，取全肺稱重，按如下公式計算肺系數(shù)。肺系數(shù)=雙肺濕重/大鼠體重。同時取右肺固定部分稱重，置烘箱（80℃，48 h）烘至恒重后，再次稱重，計算肺含水量。肺含水量=（濕肺重-干肺重）/濕肺重×100%，判別水腫程度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況及病理學檢查結(jié)果

試驗前各組動物在靜息狀態(tài)下呼吸平穩(wěn)，注射油酸后B組動物立即出現(xiàn)呼吸急促、煩躁，約20～30 min后出現(xiàn)呼吸窘迫，呼吸頻率增加，紫紺；C組、D1組、D2組及D3組動物反應較輕；A組動物未見明顯變化。裸眼下，B組動物肺體積增大；其余各組動物肺體積有所增大，但程度較輕。光鏡下，B組動物肺表面可見廣泛灶狀出血，內(nèi)皮受損，肺泡壁顯著增厚，肺間質(zhì)水腫，有大量紅細胞、白細胞浸潤和部分肺泡萎縮；除A組外其余各組充血、水腫表現(xiàn)較輕；A組未見充血、水腫表現(xiàn)。

2.2 觀察指標測定結(jié)果

根據(jù)EBD含量（每100 mL肺組織中含EBD的質(zhì)量）與吸光度A 建立回歸方程，Y=3.158 0 X-0.041 6，r=0.996 1（n=6）。EBD含量-吸光度標準曲線見圖1。各觀察指標測定結(jié)果見表1。

圖1 EBD含量-吸光度標準曲線

表1 各組觀察指標測定結(jié)果（X ± s，n=10）

表1結(jié)果顯示，急性肺損傷時，BALF中滲出細胞數(shù)量顯著增加，地塞米松能使升高的BALF中滲出細胞數(shù)量明顯降低，大、中劑量野馬追提取液能有效阻止急性肺泡上皮損傷的炎性細胞滲出；BALF中蛋白含量顯著增加，會導致肺通透指數(shù)變大，地塞米松能有效抑制肺通透指數(shù)增加，大、中劑量野馬追提取液能有效防止急性肺泡上皮炎癥損傷，降低肺泡的通透性；大、中劑量野馬追提取液能劑量依耐性地降低急性油酸性肺損傷所致的肺血管通透性；肺含水量顯著增加，地塞米松能有效防止急性肺損傷時所致的肺含水量增加，大劑量野馬追提取液也有類似效應；肺系數(shù)變大，地塞米松能有效防止肺系數(shù)增加，大、中劑量野馬追提取液也有類似效應。

3 討論

油酸是一種毒性較強的飽和脂肪酸，主要通過氧化應激反應、促凝血活性增高以及內(nèi)皮素作用等機制導致肺損傷，破壞肺泡上皮屏障；同時其對肺毛細血管內(nèi)皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞等有直接毒性作用。本試驗中，油酸致傷組大鼠表現(xiàn)為明顯紫紺、呼吸急促或呼吸窘迫，嚴重低氧血癥，結(jié)合病理觀察顯示肺間質(zhì)充血、出血、炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)和肺泡水腫及部分肺泡萎縮，表明大鼠油酸性肺損傷模型制備成功。

野馬追為菊科澤蘭屬植物二葉尖佩蘭，多年生草本，以全草入藥，所含化學成分主要有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油和香豆精等。其味苦、性平，具有清肺、止咳、平喘和抗菌、抗病毒等功效，臨床用于祛痰止咳、平喘抗炎等。野馬追對大鼠急性肺損傷有明顯的保護作用[2]。本試驗結(jié)果顯示，野馬追能明顯改善靜脈注射油酸后所致的急性肺損傷癥狀，并能夠降低BALF中細胞數(shù)量和蛋白含量，減輕肺水腫，降低肺系數(shù)，降低肺血管的通透性。肺血管通透性是維持肺間質(zhì)和肺泡水分及溶質(zhì)穩(wěn)定的重要因素，ARDS就是以肺泡-毛細血管膜的高通透性為病理特征的ALI，此時液體和蛋白由血管腔進入間質(zhì)間隙和肺泡，從而形成致命性肺水腫和呼吸衰竭[6]。因此，肺血管通透性升高是ARDS和ALI發(fā)病的重要機制，野馬追對急性肺損傷的治療作用可能部分是通過降低肺血管通透性實現(xiàn)的。

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