沙門菌腸毒素基因克隆及序列分析

陳 瑞,熊惠軍,王培園,董劍輝,孫躍輝,宋 立

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;3.天津大學(xué),天津 300072)

沙門菌腸毒素基因克隆及序列分析

陳 瑞1,2,熊惠軍1,王培園1,董劍輝1,2,孫躍輝3,宋 立2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;3.天津大學(xué),天津 300072)

研究常見的不同血清型沙門菌腸毒素(stn)基因核苷酸序列之間的差異及其分布情況。根據(jù)沙門菌的stn核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,應(yīng)用PCR技術(shù),分別對(duì)腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆及序列分析,并用所設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)7種血清型沙門菌(42株)。結(jié)果顯示,3種沙門菌經(jīng)PCR均擴(kuò)增出749 bp的特異條帶,DNA序列分析證實(shí),沙門菌的stn核苷酸序列比較保守,42株沙門菌stn的檢出率為100%。本試驗(yàn)成功克隆出沙門菌的stn,調(diào)查其在不同血清型沙門菌中的分布及序列分析,為進(jìn)一步研究stn致病機(jī)理及研制減毒沙門菌活菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。

沙門菌;腸毒素基因;序列分析

*通訊作者

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科中一大類致病菌,是一種重要的人獸共患病病原[1],其血清型有2 500個(gè)以上[2]。沙門菌感染畜禽后可引起一系列的腸道疾病,成為畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來(lái)源,并可通過(guò)各種途經(jīng)傳染給人,引起人的食源性疾病,嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展[3]。在世界各地的食物中毒中,沙門菌引起的中毒病例占首位[4]。有資料統(tǒng)計(jì),在我國(guó)70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門菌引起,而引起沙門菌中毒的食品中,約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品[5]。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),腸毒素基因(enterotoxin gene)stn是沙門菌致病機(jī)制中一個(gè)較為重要的毒力因子[6],沙門菌 stn的檢測(cè)在動(dòng)物衛(wèi)生及食品安全方面顯得較為重要。本研究對(duì)沙門菌stn進(jìn)行克隆、序列分析,并檢測(cè)其在一些血清型中的分布,為下一步的分子致病機(jī)理的研究和弱毒疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所用沙門菌株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測(cè)技術(shù)研究室保存,7個(gè)血清型,共42株,分別為鼠傷寒沙門菌(S.ty phimurium)、腸炎沙門菌(S.enterica)、雞白痢沙門菌(S.pullorum)、紐波特沙門菌(S.newport)、亞拉巴馬沙門菌(S.alabama)、哈瓦那沙門菌(S.havana)、阿姆斯特丹沙門菌(S.amsterdam)各6株。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶均為NEB公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶、pGEM-T Easy載體質(zhì)粒系統(tǒng)均為Promega公司產(chǎn)品;TOP10感受態(tài)細(xì)胞為北京天根公司產(chǎn)品;IPTG和X-gal均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)己報(bào)道的沙門菌stn基因核苷酸序列,用Premier 5.0設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,兩端含有限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ的酶切點(diǎn) :stn-F:5′-T TGGATCCATGT TAATCCTGTTGTCTCGC-3′;stn-R:5′-CGCTCGAGTTGGCAACGT TACTG-3′。該引物由 Invitrogen公司合成。

1.2.2 沙門菌的培養(yǎng)及DNA的提取 將凍存的沙門菌接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種至裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯的小試管中,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取新鮮培養(yǎng)的菌液,用煮沸法提取DNA。

1.2.3 stn基因的擴(kuò)增及純化 擴(kuò)增體系為50 μL:無(wú) 菌 水 34 μL,10 ×buffer 5 μL,dNTPs 4 μL,上下游引物各 2 μL,TaqDNA 聚合酶 1 μL,DNA樣品2 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃10 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳,按試劑盒說(shuō)明回收純化目的基因。

1.2.4 stn的克隆與序列測(cè)定 將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體上,構(gòu)建pGEM-T-stn重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞,用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。用DNA Star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比較。

1.2.5 stn的檢測(cè) 用本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物,對(duì)受試的7個(gè)血清型共42株沙門菌進(jìn)行檢測(cè),以研究其在不同血清型沙門菌中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆和鑒定

用提取的3株沙門菌基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)1條與預(yù)期片段(749 bp)大小一致的條帶(圖1)。

2.2 沙門菌的stn克隆及鑒定

將擴(kuò)增的目的基因純化與克隆載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-stn。經(jīng)氨芐青霉素篩選出的陽(yáng)性克隆,再經(jīng)PCR擴(kuò)增及BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定得到750 bp左右的片段(圖2)。

圖1 沙門菌stn PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Salmonella stn

圖2 重組質(zhì)粒pGEM-T-stn的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEM-T-stn by restriction enzymes

2.3 沙門菌stn的序列分析

本試驗(yàn)選取了3株重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析,這3株重組質(zhì)粒的stn基因分別來(lái)自3個(gè)血清型:鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌,分別標(biāo)記為S.typhimurium、S.enterica、S.pullorum。將測(cè)定的核苷酸序列進(jìn)行BLAST檢索,結(jié)果顯示,與Gen-Bank公布的鼠傷寒沙門菌stn核酸序列(登錄號(hào)L16014.1)相比,試驗(yàn)中鼠傷寒沙門菌stn基因核酸序列同源性高達(dá)100%,而腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌均為98.9%,其中有8個(gè)堿基發(fā)生突變。其stn序列同源關(guān)系如圖3所示。

圖3 沙門菌stn序列同源性Fig.3 Sequence homology of stn genes from 3 salmonella strains comparing with S.typhimurium/L16014.1

2.4 stn的檢測(cè)結(jié)果

用本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物對(duì)42株受試沙門菌的stn進(jìn)行檢測(cè),檢出率為100%,7個(gè)血清型的檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 7個(gè)血清型沙門菌stn PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of 7 serotypes of Salmonella stn

3 討論

細(xì)菌感染宿主的過(guò)程通常是先黏附到宿主組織上,進(jìn)而通過(guò)細(xì)菌的毒力因子侵襲宿主細(xì)胞,導(dǎo)致宿主患病及死亡[7]。隨著分子細(xì)菌學(xué)研究的開展,人們對(duì)細(xì)菌的毒素、侵襲素與毒力島等毒力因子的認(rèn)識(shí)也在不斷的深入[8-10]。Chopra A K等[11]首次從鼠傷寒沙門菌中成功克隆出stn的全序列。黃建華[6]在研究中證實(shí)stn是沙門菌的一個(gè)重要毒力因子。此后,關(guān)于沙門菌stn的報(bào)道比較少。

本試驗(yàn)按GenBank報(bào)道的stn核苷酸序列,設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)PCR方法對(duì)常見的7種血清型沙門菌共計(jì)42株進(jìn)行檢測(cè),檢出率為100%。因此,推斷在常見血清型的沙門菌中stn可能普遍存在。由于本試驗(yàn)所涉及的受試菌株量比較少,至于其是否一定在不同血清型中普遍存在,還有待進(jìn)行一步深入研究。

沙門菌病在獸醫(yī)臨床上比較常見,從免疫學(xué)角度來(lái)講,對(duì)易感動(dòng)物注射疫苗是預(yù)防該病最有效的措施,而且,國(guó)際上有專家在倡導(dǎo)用疫苗控制沙門菌病[12]。目前,常用的疫苗有兩大類,一類為滅活疫苗,另一類為弱毒活疫苗。由于滅活苗具有容易引起全身及局部反應(yīng)、只能激發(fā)體液免疫、需多次加強(qiáng)免疫等缺點(diǎn),此類疫苗的應(yīng)用受到限制[13]。弱毒沙門菌在誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)方面比滅活苗或亞單位苗更為有效[14]。stn是沙門菌的一個(gè)重要毒力因子,因此,可以運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建沙門菌stn突變菌株,通過(guò)對(duì)stn的突變而降低該菌的致病性,從而研制減毒活菌疫苗。本研究通過(guò)對(duì)stn的成功克隆并測(cè)序,為進(jìn)一步開發(fā)減毒活菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。

本研究還選擇了我國(guó)常見且與公共衛(wèi)生有密切關(guān)系的腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌的stn測(cè)序、分析,結(jié)果表明,3種常見的不同血清型沙門菌株的 stn核苷酸序列同源性較高,為在98.9%～100%之間。通過(guò)GenBank上的Blast檢索,該序列與其他生物無(wú)同源關(guān)系,說(shuō)明所克隆的序列在沙門菌不同血清型沙門菌中具有高度保守性。如果通過(guò)進(jìn)一步深入研究,有望將stn作為檢測(cè)沙門菌繼invA基因、16 S RNA基因、sefA基因、hin/H2區(qū)域、arfA基因、fimA基因[15-16]之后的又一個(gè)新的靶基因。

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Cloning and DNA Sequence Analysis of Enterotoxin Gene fromSalmonella

CHEN Rui1,2,XIONG Hui-jun1,WANG Pei-yuan1,DONG Jian-hui1,2,SUN Yue-hui3,SONG Li2

(1.South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China;
2.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing100081,China;3.Tianjin University,Tianjin,300072,China)

In this article,we investigated the diversity in DNA sequence of enterotoxin gene(stn)from differentSalmonellaserotypes and its distribution inSalmonella.A pair of oligonucleotide primers were designed according to the stn gene nucleotide sequence ofSalmonella,and the stn genes were amplified fromS.typhimurium,S.enterica,S.pullorum.The specific PCR products were cloned and sequenced.7 serotypesSalmonella(42 strains)were detected by PCR,an expected 749 bp band was successfully amplified,and the DNA sequences of stn genes fromSalmonellawere conservative.The detection rate of stn genes from 42Salmonellastrains is 100%.The stn genes were cloned successfully in this experiment,distribution and sequence analysis of stn genes from differentSalmonellaserotypes were investigated,and it provides a new insight for studying on the pathogenesis and attenuated live vaccine ofSalmonella.

Salmonella;enterotoxin gene;sequence analysis

S852.612

A

1007-5038(2010)09-0025-04

2010-03-15

國(guó)家“十一五”科技支撐子課題(2006BAK02A03-1)

陳 瑞(1984-),男,河南南陽(yáng)人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性研究。