豬肺炎支原體YN200901株的分離鑒定*

楊貴樹,畢峻龍,楊金鳳,蒲楊柳,周建瓊,尹革芬

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

豬肺炎支原體YN200901株的分離鑒定*

楊貴樹,畢峻龍,楊金鳳,蒲楊柳,周建瓊,尹革芬*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

采集疑似豬肺炎支原體病理變化的肺臟,接種到改良牛心培養(yǎng)基、豬胃消化液培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)瑞特染色、鏡檢,菌落狄氏染色、PCR鑒定及序列比對(duì)、生化試驗(yàn)鑒定,抗豬肺炎支原體血清生長(zhǎng)抑制試驗(yàn),分離獲得一株豬肺炎支原體云南地方流行菌株,命名為YN200901。試驗(yàn)結(jié)果為云南本地株豬肺炎支原體的后續(xù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

豬肺炎支原體;YN200901株;分離鑒定

*通訊作者

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又稱豬地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumonia),俗稱豬喘氣病[1]。豬支原體是豬呼吸道疾病綜合征的重要病原之一[2],可繼發(fā)感染PRRSV、PCV等,從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗[3-4]。豬支原體可經(jīng)空氣傳播,此外還易與其他細(xì)菌性疫病如豬肺疫、傳染性胸膜肺炎等并發(fā)[5-6],對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。是當(dāng)前常發(fā)生、流行廣、難凈化的重要疫病之一。

豬肺炎支原體常呈亞臨床感染,長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)該病原的檢測(cè)主要以病原菌的分離鑒定為主。由于豬肺炎支原體生長(zhǎng)條件苛刻、營(yíng)養(yǎng)要求高、生長(zhǎng)速度緩慢,使得本病的控制常呈現(xiàn)滯后狀態(tài),影響了其在遺傳、生化、免疫等方面的研究[7]。因此加快豬肺炎支原體的生長(zhǎng)速度,可為豬肺炎支原體的診斷提供寶貴的時(shí)間。本試驗(yàn)對(duì)常規(guī)分離豬肺炎支原體的培養(yǎng)基進(jìn)行改良,采用自制改良牛心培養(yǎng)基、豬胃消化液培養(yǎng)基進(jìn)行豬肺炎支原體的培養(yǎng),縮短了培養(yǎng)時(shí)間,成功分離獲得了豬肺炎支原體,為豬肺炎支原體云南地方株的后續(xù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 標(biāo)準(zhǔn)豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)菌株購(gòu)自江西農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 病料來(lái)源 分別采自云南省各地疑似豬肺炎支原體病變肺臟,共10份。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備 參照“中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”豬肺炎支原體分離培養(yǎng)基制備方法,根據(jù)需要略有改動(dòng)。

1.1.4 生化試劑 均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 將病料放在無(wú)菌平皿中剪成1 mm3的小塊,直接接種于培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)10 d～14 d,每天觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化情況[8]。1.2.2 鏡檢 用鉑耳挑取液體培養(yǎng)基中的菌液涂片,自然干燥經(jīng)甲醇固定后,用瑞特染色30 min,然后鏡檢。

1.2.3 菌落狄氏染色 采用無(wú)菌方法從固體培養(yǎng)基上切下菌落,放到載玻片上,在兩邊墊上竹簽,滴上狄氏染色液后再蓋上一塊玻片,用石蠟密封后,置于4℃染色30 min后低倍鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR鑒定 根據(jù)GenBank中MHP16s rDNA中基因系列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,MHP-F 5′-GAG CCT TCA AGC TTC ACC AAG A-3′,MHPR 5′-TAT GTT AGT GAC T TT TGC CAC C-3′并提交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。優(yōu)化反應(yīng)體系及條件,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定及分析。

1.2.5 生化試驗(yàn) 從毛地黃皂甙敏感性試驗(yàn)開始,接著是尿素酶試驗(yàn)、葡萄糖分解試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、三苯基氯化四氮唑(T TC)還原試驗(yàn)、七葉甙水解試驗(yàn)、甘露醇分解試驗(yàn)、薄膜和斑點(diǎn)形成試驗(yàn)。

1.2.6 血清學(xué)鑒定 將直徑為6 mm的濾紙片高壓滅菌烘干后,每片用0.02 mL豬肺炎支原體抗血清浸透,室溫空氣干燥,置-30℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)將分離菌的純培養(yǎng)菌液以滾滴法接種于固體培養(yǎng)基上,當(dāng)液體吸收后,貼上含豬肺炎支原體抗血清的紙片,于37℃恒溫培養(yǎng),每天觀察記錄,出現(xiàn)菌落后記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)11 d后,培養(yǎng)基變黃色均勻混濁的液體。轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基后,菌落生長(zhǎng)入培養(yǎng)基內(nèi)部。菌落呈典型“煎荷包蛋”狀,與支原體菌落形態(tài)相符。

2.2 狄氏染色結(jié)果

在低倍鏡下觀察到,豬肺炎支原體的菌落被染成不褪色的中心深藍(lán)色菌落(圖1A),與支原體菌落染色特性相符;而細(xì)菌的菌落則退色(圖1B)。

圖1 狄氏染色結(jié)果Fig.1 Disse staining results of under light microscope

2.3 PCR鑒定

所提取的分離培養(yǎng)物模板用Mhp-F和Mhp-R引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后,再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)菌株及待檢病料均在600 bp～700 bp之間相對(duì)應(yīng)位置有一條帶,與預(yù)期649 bp相符(圖2)。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Result of PCR

2.4 序列測(cè)定與分析

將所分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與GenBank中Mhp部分序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果可以看出,云南分離菌株16 S rRNA基因序列與參考菌株相應(yīng)序列同源性為98.3%～100%(圖3)。

圖3 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果Fig.3 Sequence alignments of isolation amplified by PCR

2.5 生化及血清學(xué)鑒定

分離菌株生化反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)菌株相同,符合支原體生化特性(表1)。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)及血清學(xué)鑒定Table 1 Biochemical tests and serological identification of isolates

(續(xù)表1)

3 討論

豬肺炎支原體除了能引起豬地方流行性肺炎外,也是豬呼吸道疾病綜合癥的一種原發(fā)性病原[9]。張其燕等[10]曾報(bào)道昆明某豬場(chǎng)發(fā)生豬支原體病。豬肺炎支原體營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)緩慢,因此很難獲得大量的菌株,造成了豬肺炎支原體診斷所需時(shí)間長(zhǎng)、防控困難等,因此加快豬肺炎支原體的生長(zhǎng)速度就顯得非常重要。趙萍等[11]對(duì)絲狀支原體山羊亞種最佳培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選獲得成功,提示可通過(guò)研究豬支原體的營(yíng)養(yǎng)需求生理,在原有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良,縮短培養(yǎng)周期。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基的組成成分中使用牛心浸液、豬胃消化液、水解乳蛋白、NAD組合。這個(gè)組合中能很好提供支原體生長(zhǎng)繁殖所需的含氮物質(zhì)、核酸降解物、維生素及無(wú)機(jī)鹽類,還能中和蛋白胨和瓊脂所含有的阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì),可以防止支原體向粗糙型變異,具有保持支原體毒力和毒性作用。另外,豬肺炎支原體的生物合成能力弱,加入NAD可以在豬肺炎支原體的呼吸過(guò)程中起到遞氫作用[12]。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)該培養(yǎng)基能夠很好的分離出豬肺炎支原體,在3 d內(nèi)就可見菌株生長(zhǎng)。其生長(zhǎng)速度有了很大提高,為豬肺炎支原體的分離鑒定縮短了時(shí)間也為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。

從感染的肺臟中分離豬肺炎支原體是被推崇的“金標(biāo)”診斷方法[13],但周期較長(zhǎng)。建立快速檢測(cè)方法有助于本病的研究和控制[14]。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)MHP 16 S cDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增得到一個(gè)大小為649 bp的特異性片段。經(jīng)克隆、測(cè)序后與GenBank中Mhp部分序列進(jìn)行同源性比較,為98.3%～100%。表明PCR鑒定和分離鑒定具有一致性,建立了一套快速準(zhǔn)確的豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法。

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Isolation and Identification ofMycoplasma hyopneumoniaeYN200901 Strain

YANG Gui-shu,BI Jun-long,YANG Jin-feng,PU Yang-liu,ZHOU Jian-qiong,YIN Ge-fen

(College of Animal Science and Technology,Y unnan Agricultural University,Kunming,Yunnan,650201,China)

Samples from swine lungs with suspected pathological lesions due to swine enzootic pneumonia were collected,inoculated into improved cattle heart and pig stomach digestion medium for isolation and culture.Wright＇s staining,bacterial colony of disse staining,bacterial L-type identification,biochemical tests,anti-Mycoplasma hyopneumoniaegrowth inhibition test as well as PCR and sequence alignments for comfirming the bacteria strain were conducted.Based on the results,strain was isolated as swine pneumonia mycoplasma,enzootic in Yunnan province named YN200901 which can be applicable studies.

Mycoplasma hyopneumoniae;YN200901 strain;isolation and identification

S852.62;S858.28

A

1007-5038(2010)09-0022-04

2010-03-03

云南省高端科技人才引進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目(2009CI125)

楊貴樹(1968-),男,云南昆明人,實(shí)驗(yàn)師,主要從事動(dòng)物傳染病防制研究。