Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記

趙科研 柳克祥 侯明曉 孫江濱 吳慧穎 李 博

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院心血管外科,吉林 長春 130041)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞,可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化〔1,2〕,具有高度可塑性,易于體外擴(kuò)增,因其來源充足、取材方便,體外增殖能力相對較強(qiáng),而且在異體移植中排斥反應(yīng)小,被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞,為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng) MSCs的基礎(chǔ)上,優(yōu)化 MSCs純化、鑒定、標(biāo)記的方法,以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系,為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性 Wistar大鼠(3周鼠齡,60～70 g),吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑和藥品 低糖 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),特級胎牛血清(Gibco公司),胰酶(Sigma公司),亞美尼亞倉鼠抗大鼠 CD29-Alexa Fluor(Biolegend公司),小鼠抗大鼠 CD45-過氧化物酶(FITC)(Biolegend公司),小鼠抗大鼠CD44-PE(Santa Cruz公司),小鼠抗大鼠 CD34-FITC(Santa Cruz公司),4-6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)儲存液(Sigma公司)。

1.3 分離和培養(yǎng) Wistar大鼠麻醉后處死,浸泡酒精 15 min,無菌條件下分離股骨、脛骨,無血清DMEM沖洗骨髓腔,取混懸液,1 000r/min離心 10min,棄上清液,沉淀含 10%胎牛血清的DMEM混懸,將獲得的細(xì)胞接種在 100 ml培養(yǎng)瓶中,5%CO2,37℃下培養(yǎng) 24～48 h,換液,去除未貼壁細(xì)胞,2～3 d更換一次培養(yǎng)基,光鏡觀察細(xì)胞融合情況,細(xì)胞 80%融合后傳代,0.25%胰酶消化,用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞、傳代,培養(yǎng) 3～5代細(xì)胞。

1.4 透射電鏡樣品制備 將培養(yǎng) 3代 10 cm2培養(yǎng)皿中約 2×106個細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 3次,再以 3%戊二醛4℃固定 1h,送電鏡室,脫水包埋并制作超薄切片,行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標(biāo)記物檢測 0.25%胰酶消化收獲第 3代細(xì)胞,收集 1×106個細(xì)胞,洗滌 1次,0～4℃預(yù)冷的 70%乙醇1ml邊加入邊搖勻,混勻后置于 4℃冰箱待進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測。檢測時以 1 ml PBS洗滌 2次,加含 10%山羊血清的 PBS常溫孵育 10 min,1 000r/min離心 5min去上清,與飽和濃度的CD29-Alexa Fluor、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-FITC單克隆抗體及其同型對照混勻,室溫下閉光反應(yīng) 30 min,PBS洗滌細(xì)胞,置于冰上,行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 MSCs標(biāo)記 將無菌的 DAPI儲存液加入培養(yǎng)的 MSCs爬片上清中,至終濃度為 50 mg/L,37℃孵育染色至少 30 min。細(xì)胞至少用 Hanks平衡鹽溶液沖洗 6遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后,約 6～8 h可見 MSCs細(xì)胞貼壁,呈圓形或多角形,換液后,貼壁細(xì)胞清晰可見,2～3 d后可見少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長,伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀;6 d左右可見放射狀排列的細(xì)胞集落,伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰。約 14d細(xì)胞融合 80%～90%,呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快,24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展,增殖迅速,均勻分布生長,3～4 d可見長梭形細(xì)胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖 1。

圖1 相差顯微鏡下 MSCs形態(tài)(×100)

2.2 MSCs的超微結(jié)構(gòu) 大鼠MSCs胞質(zhì)較豐富,可見較多的細(xì)胞器,如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體等,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,也可見不規(guī)則形核,核染色質(zhì)較疏松?？梢娒黠@核仁,多為 1～2個。有的表面可見較多的微絨毛。見圖 2。

2.3 MSCs的鑒定及標(biāo)記 第 3代細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD29、CD44、CD34和 CD45的陽性率分別為 98.6%、78.2%、0.0%、0.3%。見圖 3。細(xì)胞經(jīng) DAPI標(biāo)記后,細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖 4。

圖2 MSCs第 3代超微結(jié)構(gòu)(×4 000)

圖3 M SCs第 3代細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)

圖4 MSCs第 3代細(xì)胞 DAPI標(biāo)記

3 討 論

由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜,細(xì)胞功能各異,其中MSCs含量很低,約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的 0.001% ～0.01%〔3〕,故分離高純度的 MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前,獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單,既降低了離心對細(xì)胞的損害,又減少了污染機(jī)會,且分離的MSCs貼壁時間短,增殖快,細(xì)胞數(shù)量多,經(jīng)傳代后能夠純化,提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。

一般認(rèn)為,間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性表面抗原,整合素家族成員 CD29、黏附分子 CD44、CD166、CD105等是 MSCs的重要標(biāo)志物〔5〕,而 MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原,如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原 CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原 CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原 CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原 CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原 CD14。因此,實(shí)驗(yàn)選取 MSCs表達(dá)陽性的指標(biāo) CD29、CD44,以及表達(dá)陰性的指標(biāo) CD34和 CD45作為鑒定參考指標(biāo)〔2,6〕。本研究選擇了 CD29、CD34、CD44和 CD45進(jìn)行檢測,結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞 CD29和 CD44陽性,CD34和CD45陰性,符合 MSCs的特點(diǎn),經(jīng)過傳代,第三代可獲得較高純度的 MSCs,可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。

DAPI是一種能夠與 DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料,常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細(xì)胞無毒性,不改變細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu),熒光保持時間較長。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的,目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞,且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等不足。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動物細(xì)胞移植到雌性動物體內(nèi),通過 Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于可以終生標(biāo)記,但也存在操作繁瑣,無法觀察活細(xì)胞等不足?；驑?biāo)記法通過基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動物取材,使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白(GFP)暼報告基因。但目前,實(shí)現(xiàn)報告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長、成功率低等困難,而從轉(zhuǎn)基因動物取材又因?yàn)閯游飦碓蠢щy,在國內(nèi)較少開展〔7〕。本研究表明,DAPI起初標(biāo)記率很高(接近100%),1 w內(nèi)可維持 80%～90%標(biāo)記率。但隨著標(biāo)記時間的延長,其標(biāo)記效率迅速下降,3 w以后絕大多數(shù)細(xì)胞失去標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)完善貼壁法建立 Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系,經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高,可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細(xì)胞。采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后,熒光顯微鏡下見所有MSCs均已被標(biāo)記藍(lán)色熒光,提示 DAPI標(biāo)記法敏感性好,標(biāo)記效率高,可應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植的良好標(biāo)記。

1 Gnecchi M.Melo LG.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells:Isolation,expansion,characterization,viral transduction,and production of conditioned medium〔J〕.Methods Mol Bol,2009;482:281-94.

2 楊 麗,張榮華,謝厚杰,等.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009;13(6):1064-8.

3 Wakitani S,Saito T,Caplan AL.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine〔J〕.Muscle Nerve,1995;18:1417-26.

4 賴平平,韓春茂,岑航輝,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)性狀〔J〕.浙江醫(yī)學(xué),2004;26(5):328-30.

5 De Ugarte DA,Alfonso Z,Zuk PA,et al.Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow〔J〕.Immunol Lett,2003;89(2-3):267-70.

6 Shahdadfar A,Fronsdal K,Haug T,et al.In vitro expansion of human mesenchymal stem cells:choiceof serum is a determinant of cell proliferation,differentiation,gene expression,and transcriptome stability〔J〕.Stem Cells,2005;23(9):1357-66.

7 李玉玲,唐俊明,潘國棟,等.DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外示蹤實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005;24(5):257-9.