商秀麗 沈向宏 趙潤秋 趙久晗 曹云鵬
(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 沈陽 110001)
流行病學(xué)研究表明阿爾茨海默病(AD)發(fā)病年齡一般在 65歲以上,約 33%的女性和 20%的男性可能發(fā)生AD,在未來 50年內(nèi),AD的發(fā)病率將達到現(xiàn)在的 4倍〔1〕。AD女性發(fā)病率較男性高,可能是由于絕經(jīng)后婦女缺乏內(nèi)源性雌激素保護。雌激素替代治療是防治 AD的方法之一,但對于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機制尚不清楚。我們認為AD模型大鼠學(xué)習、記憶能力下降可能與 N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)蛋白表達的變化有關(guān)〔2〕。為進一步探討雌激素對 AD動物模型的學(xué)習、記憶能力的影響及可能機制,本研究擬采用立體定位注射的 AD動物模型,檢測雌激素剝奪和替代治療對動物模型學(xué)習和記憶的影響,并進一步探討雌激素保護作用的可能機制。
1.1 試驗動物分組 健康 SD雌性大鼠 30只,3~4月齡,體重 200~250 g(中國醫(yī)科大學(xué)動物部提供),隨機均分為雌激素替代治療(ERT)組和卵巢切除術(shù)(OVX)組。
1.2 雙側(cè)卵巢切除術(shù) 剪開大鼠腰背部皮膚,切口約 2.0~3.0cm,先使動物右側(cè)臥位,在最末肋骨下緣 1 cm處沿脊柱旁切開肌肉,打開腹腔,將腎臟下方的脂肪拉出可見紅色顆粒樣腺體為卵巢,結(jié)扎并切除卵巢,觀察切口處無出血后關(guān)腹;使動物轉(zhuǎn)向左側(cè),同樣方法取出右側(cè)卵巢〔3〕。注意無菌操作,皮膚切開處給予少許青霉素粉劑,縫合切口。
1.3 雌激素替代治療 2w后ERT組給予苯甲酸雌二醇替代治療,肌肉注射苯甲酸雌二醇 0.2mg/kg(上海通用藥業(yè)股份有限公司提供,批號:31021114),共 30 d。OVX組給予同等劑量的橄欖油。
1.4 AD動物模型制備 β-淀粉樣肽(Aβ)由美國 Sigma公司提供。 首先 將 Aβ1~40孵育,用生理 鹽水將 Aβ1~40稀釋成10μg/μl,37℃孵育 1 w,使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的 Aβ1~40。 SD大鼠 10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上,常規(guī)備皮消毒,切開頭部皮膚,暴露硬腦膜。定位海馬齒狀回背側(cè)細胞帶 (前囟后 3.3 mm,旁開 1.5 mm,顱骨表面下3.3mm)。微量進樣器自腦表面垂直進針,緩慢將 Aβ1~401μl(10μg/μl)注入,注射速度為 5 μl/h,留針 0.5 h,使 Aβ1~40充分浸潤局部組織,縫合切口,常規(guī)飼養(yǎng)。
1.5 Morris水迷宮測定 待 Aβ1~40注射 2 w后再測水迷宮潛伏期。即記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間,此時間稱逃避潛伏期。每一時間段內(nèi) 4次潛伏期的算術(shù)平均數(shù)為這一時段的成績進行統(tǒng)計分析。
1.6 取材及NMDAR1蛋白表達檢測 2 w后,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后立即斷頭取腦,剝離大腦并沿正中線分兩個半球,在冰冷生理鹽水中漂洗后置于液氮中保存。在恒冷箱 (-20℃)切片機上做 15μm連續(xù)切片,將其貼于APES包被的載玻片上晾干,于含 0.1%DEPC的 4%多聚甲醛溶液中固定 10min,然后在 0.1%DEPC水中漂洗、晾干,置于 -70℃冰箱備用。NMDAR1蛋白免疫組織化學(xué)試劑盒為兔抗大鼠多克隆抗體,由武漢博士德公司提供。切片脫蠟至水,抗原修復(fù),加正常山羊血清室溫下封閉 30~60 min,滴加兔抗 NMDAR1抗體 (1∶200),37℃水浴中孵育 2 h,再滴加羊抗兔 IgG(二抗)37℃水浴中孵育 30 min,最后以DAB、H2O2顯色液室溫顯色 5 min終止。水洗、脫水及封片后,光鏡下觀察。用圖像分析儀分別測海馬 CA 1、CA 2、CA3、DG及額葉皮層的平均灰度值。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)用 x±s表示,使用 SPSS11.5軟件包進行 t檢驗。
2.1 Morris水迷宮結(jié)果 行為學(xué)研究結(jié)果顯示 ERT組 AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期與 OVX組相比明顯縮短(P<0.05),見表 1,表明雌激素替代治療能改善 AD動物模型的空間學(xué)習記憶能力。
表1 AD模型大鼠水迷宮實驗結(jié)果(x±s,n=15,s)
2.2 NMDAR1免疫組化結(jié)果 ERT組 AD動物模型的海馬CA1、CA3區(qū)及額葉皮質(zhì)的 NMDAR1表達陽性細胞與 OVX組相比明顯增多(P<0.05),ERT組AD動物模型的海馬 CA1、CA3區(qū)及額葉皮質(zhì)的 NMDAR1蛋白表達的平均灰度值與 OVX組相比顯著降低(P<0.05),表明雌激素替代治療可以上調(diào)AD動物模型 NMDAR1的蛋白表達。見圖 1,表 2。
圖1 AD模型大鼠 NM DAR 1蛋白表達(×400)
表2 各組大鼠NMDAR1蛋白表達(x±s,n=15)
本研究利用 Aβ立體定位單側(cè)海馬內(nèi)注射建立 AD動物模型,通過水迷宮實驗檢測動物模型行為學(xué)的學(xué)習記憶能力改變,免疫組化方法檢測 NMDAR1蛋白表達情況。結(jié)果顯示ERT組AD動物模型的水迷宮逃避潛伏期較OVX明顯縮短,同時 ERT組 AD動物模型的海馬 CA 1、CA 3區(qū)及額葉皮質(zhì)的NMDAR1的蛋白表達上調(diào),表明雌激素替代治療可以改善AD動物模型的認知功能,其神經(jīng)保護作用可能與上調(diào) NMDAR1的蛋白表達有關(guān)。
NMDAR是目前研究最為深入的興奮性氨基酸受體之一,是一種離子型受體。NMDAR在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)從大腦皮層到脊髓都有廣泛分布,其中以大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)的密度最高。NMDAR蛋白之 cDNA表達兩個亞單位,即 NMDAR1和 NMDAR2,其中 NMDAR1具有 NMDAR的一切藥理學(xué)和電生理學(xué)特性,是必需功能亞基,而 NMDAR2蛋白單獨存在時并不表現(xiàn)受體活性,只是在與 NMDAR1蛋白結(jié)合后對其功能及特性起輔助修飾作用。而且 NMDAR1的分布可以代表整個NMDAR的分布情況,因此本研究僅對 NMDAR1的表達進行檢測即可以反映 NMDAR表達的改變。
本研究結(jié)果表明雌激素替代治療可以改善 AD動物模型的認知功能,其機制可能與上調(diào) NMDAR1的蛋白表達有關(guān)。有關(guān)雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病保護作用的研究顯示,雌激素無論是在 Aβ作用之前、之后,還是二者同時給予,均可阻斷 Aβ的神經(jīng)毒作用;提前給予時,作用最為顯著,提示雌激素不但可防止 Aβ沉積,而且還可阻斷 Aβ沉積后對神經(jīng)元的毒性作用〔4〕。另外,NMDAR在突觸可塑性的形成中有重要作用。NMDAR電流的易化使電流輸入到海馬 CA 1區(qū)錐體細胞來調(diào)整學(xué)習和記憶〔5〕。但雌激素具體通過何種機制來調(diào)整NMDAR電流目前尚不清楚,NMDAR可能參與介導(dǎo)了多條通路,并在其中發(fā)揮了重要作用,最終達到調(diào)節(jié)學(xué)習記憶的能力〔6〕。離體海馬腦片研究表明在 AD等變性疾病引起的智能損害中,海馬CA1區(qū) NMDAR是減少的,應(yīng)用適當?shù)腘MDAR激動劑可以改善智能障礙,并能明顯增加 NMDAR的密度,促進突觸體谷氨酸釋放,加強海馬腦片上 LTP的幅度,腦皮層厚度及海馬 CA 1區(qū)突觸數(shù)增加,對學(xué)習記憶過程有促進作用〔7〕。研究表明〔8〕雌激素的這種直接調(diào)節(jié)作用需要NMDA受體和雌激素受體在個體神經(jīng)元中共同表達,分別在下丘腦的腹正中核和弓狀核及扁桃體中 52.5%,61.5%和 51%的神經(jīng)元中有 NMDAR-mRNA和雌激素受體 mRNA共區(qū)域化。兩者共同表達支持了谷氨酸受體和雌激素在雌激素作用的女性生殖行為和神經(jīng)內(nèi)分泌功能區(qū)中具相互作用。Adams等發(fā)現(xiàn)雌激素對 NMDAR體在 CA1區(qū)域突觸和亞突觸上錐體細胞的分布具有影響,可使老化的CA1區(qū)中 NMDAR水平上升至年輕水平〔9〕。而我們的研究結(jié)果顯示,大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞有適量 NMDAR1的表達,ERT組的 AD大鼠模型的NMDAR1在海馬及額葉皮層中表達上調(diào),表明 NMDAR1的表達的改變參與了雌激素改善 AD大鼠模型的學(xué)習記憶的病理生理過程,因此我們推測雌激素的腦保護作用可能與調(diào)節(jié) NMDAR1的蛋白表達有關(guān)。NMDAR1的蛋白表達上調(diào),可能有助于神經(jīng)功能的代償和恢復(fù),進而改善大鼠的學(xué)習和記憶。
綜上,ERT的 AD大鼠模型的NMDAR1的蛋白表達發(fā)生改變,而這種改變可能是雌激素導(dǎo)致大鼠學(xué)習記憶改善的分子機制之一。本研究為 NMDAR1在雌激素治療 AD中的作用提供了一個實驗證據(jù)。為進一步尋找有效措施,充分上調(diào) NMDAR1的蛋白表達,最終改善學(xué)習和記憶的能力提供理論依據(jù)。
1 Peter P,Michelle C,Brenda L,et al.Hormone replacement therapy and incidence of Alzheimer disease in older women the cathe county study〔J〕.JAMA,2002;288(18):2123-9.
2 Shang XL,Xu WP,Liu YH,et al.Expression of MAPK in the hippocampus of Alzheimer′s disease rats model〔J〕.Neuroscience Bulletin,2005;21(4):296-300.
3 Klein RL,Hirko AC,Meyers CA,et al.NGFgene transfer to intrinsic basal forebrain neuronsincreases cholinergic cell size and protectsfrom agerelated,spatial memory deficits in middle-age rats〔J〕.Brain Res,2000;875(1-2):144-51.
4 Hong-Goka BC,Chang FL.Estrogen receptors alpha and beta in choroids plexus epithelial cells in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett,2004;360(3):113-6.
5 Giovannini MG,Scali C,Bellucci A,et al.Beta-amyloid-induced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the P38 MAPK pathway〔J〕.Neurobiol Dis,2002;11(2):257-74.
6 Bliss TV,Collingridge GL.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus〔J〕.Nature,1993;361(6407):31-9.
7 Wesnes KA,Faleni RA,Hefting NR,et al.The cognitive,subjective,and physical effects of a ginkgo biloba/panax ginseng combination in healthy volunteers with neurasthenic complaints〔J〕.Psychopharmacol Bull,1997;33(4):677-83.
8 Kia HK,Yen G,Krebs CJ,et al.Colocalization of estrogen receptor alpha and NMDA-2D mRNAs in amyloid and hypothalamic nuclei of the mouse brain〔J〕.Mol Brain Res,2002;104(1):47-54.
9 Adams MM,Fink SE,Janssen WG,et al.Estrogen modulates synaptic N-methyl-D-asparate receptor subunit distribution in the aged hippocampus〔J〕.Comp Neuorl,2004;474(3):419-26.