獨(dú)活對(duì)癡呆大鼠腦中 p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

張 杰 杜文彬

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032)

阿爾茨海默病(AD)是發(fā)生在早老及老年期、不可逆轉(zhuǎn)的、漸進(jìn)性的、以精神行為異常為主的腦變性疾病,晚期可危及患者的生命,其發(fā)病率和死亡率逐年上升。AD的病理機(jī)制尚未明確。近年發(fā)現(xiàn)非甾類抗炎藥對(duì)本病具有一定的治療作用,進(jìn)而使本病的免疫炎癥假說得到關(guān)注。本病在中醫(yī)屬癡呆的一種,中醫(yī)多認(rèn)為以五臟虛損為本,濕痰瘀為標(biāo),研究以祛風(fēng)勝濕藥獨(dú)活為本病治療的切入點(diǎn),采用非甾體抗炎藥為對(duì)照,探討?yīng)毣钤谝种?AD免疫炎性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 β-淀粉樣蛋白(1～40)的制備 Aβ1～40,瑞士巴亨公司,批號(hào)為 0710120,實(shí)驗(yàn)前 1 w以無菌生理鹽水將 Aβ1-40稀釋成2 g/L溶液,37℃溫箱孵育 1w,使其變?yōu)槟蹜B(tài)的 Aβ1～40。

1.2 模型復(fù)制 Wistar3.5月齡的雄性成年大鼠 30只,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書 SCXK遼 2003-0009號(hào)),體重為(350±21)g。大鼠經(jīng)腹腔注射 10%的水合氯醛(4 ml/kg體重)腹腔麻醉動(dòng)物。大鼠麻醉成功后,將其固定于江灣 I型 C大鼠立體定位儀上,常規(guī)備皮消毒,切開皮膚,暴露前囟,參照包新民的《大鼠腦立體定位圖》,在左右側(cè)海馬區(qū)(前囟后 3.0 cm,中線左右側(cè) 2.0cm)用微型鉆鉆開顱骨,切開硬腦膜,用微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針 2.5 cm,緩慢注入凝聚態(tài) Aβ1～401μl,留針 5 min,以使 Aβ充分彌散,然后緩慢撤針,縫合切口。假手術(shù)組注以等量生理鹽水。術(shù)后 7 d,進(jìn)行水迷宮測(cè)試。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 手術(shù)前麻醉死亡 2只,1只手術(shù)過程中死亡(假手術(shù)組),均考慮麻醉死亡。將手術(shù)后 30只隨機(jī)分為 4組,丹參組、獨(dú)活組、西藥組、模型組,每組 6只。假手術(shù)組注射生理鹽水。依據(jù)等效劑量換算直接計(jì)算法,將成人臨床用量換算為大鼠等效劑量,將上述藥物配成獨(dú)活組及丹參組每日分別以獨(dú)活丹參以上述濃度灌胃,2 ml?只-1?d-1,西藥組每日以吲哚美辛以上述濃度灌胃,2 ml?只-1?d-1,假手術(shù)組每日以生理鹽水灌胃,2 ml?只-1?d-1,共 4 s。實(shí)驗(yàn)至第 28天始,進(jìn)行藥后空間學(xué)習(xí)記憶能力訓(xùn)練測(cè)試 3 d。

1.4 標(biāo)本制備及p38 MAPK檢測(cè) 取血后,除去大鼠顱蓋,取出完整大腦組織,剝離海馬組織。采用 Western印跡法檢測(cè)海馬組 p38 MAPK,采用 Flourchem V 2.0凝膠成像分析軟件(A-merica)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較,采用配對(duì) t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 獨(dú)活對(duì)大鼠逃避潛伏期的影響 各組大鼠手術(shù)前逃避潛伏期無顯著差異(P＞0.05);各組給藥前(除假手術(shù)組)與手術(shù)前比較差異顯著性(P＜0.05)。給藥后除模型組、假手術(shù)組外,各組與給藥前比較,逃避潛伏期均有縮短(P＜0.05),見表 1。

表1 大鼠手術(shù)前后逃避潛伏期(x±s,s)

2.2 獨(dú)活對(duì)癡呆大鼠p38MAPK的影響 不同組別的大鼠海馬組織內(nèi) p38 MAPK的表達(dá)有明顯差異(P＜0.05),p38 MAPK的表達(dá)在模型組明顯升高(0.944±0.110),而假手術(shù)組的表達(dá)在較低水平(0.454±0.081),獨(dú)活組及西藥組的 p38 MAPK表達(dá)較模型組有所降低(0.512±0.039,0.528±0.013),差異顯著(P＜0.05),獨(dú)活組、西藥組 p38 MAPK表達(dá)水平較丹參組降低(0.808±0.020),但差別不顯著(P＞0.05)。丹參組與模型組比較,p38 MAPK表達(dá)有所降低,但差別不顯著(P＞0.05),見圖 1。

圖1 各組大鼠 p38MAPK表達(dá)

3 討 論

促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一,在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。p38 MAPK是 MAPK家族的主要成員之一,參與了炎癥、應(yīng)激、細(xì)胞周期調(diào)控等病理生理過程〔1,2〕,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。p38 MAPK被磷酸化激活后,可以進(jìn)一步激活其下游的激酶或多種轉(zhuǎn)錄因子,如蛋白激酶 MAPK APK 2、轉(zhuǎn)錄因子 ATF2、Erk 1等〔3〕,產(chǎn)生一系列細(xì)胞內(nèi)效應(yīng),從而誘導(dǎo)一些特定基因的表達(dá),包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、選擇素、腫瘤壞死因子 α(TNFα)、白細(xì)胞介素(IL)-1β等?；罨膒 38 MAPK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)使核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化,從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生細(xì)胞因子,引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞因子的合成,誘導(dǎo) p38-caspase-3促凋亡通路。這些基因表達(dá)產(chǎn)物在腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。另一方面,p38在 AD中主要以 2種途徑發(fā)揮炎癥相關(guān)作用:①作為炎性細(xì)胞因子的上游調(diào)控者,在細(xì)胞面對(duì)應(yīng)激時(shí)活化,參與傳導(dǎo)促炎信號(hào),通過轉(zhuǎn)錄激活增加促炎細(xì)胞因子的合成,間接引發(fā)一系列病理效應(yīng);②p38還可作為炎性細(xì)胞因子的下游信號(hào)中繼,介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的作用乃至炎癥引發(fā)的有害效應(yīng),直接破壞 AD神經(jīng)元?？傊?p 38MAPK在AD病程中可能處于一個(gè)類似炎癥過程的正反饋環(huán)內(nèi),只是由它介導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的該種物質(zhì)已不僅僅是炎癥,而是 AD中神經(jīng)元和非神經(jīng)元的各類破壞和損傷〔4〕。

鑒于 p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Aβ引起的毒性反應(yīng)中起著重要作用,探討?yīng)毣顚?duì)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用可能部分揭示獨(dú)活在 AD治療中的作用。本研究提示,獨(dú)活可抑制Aβ大鼠腦中p38 MAPK的激活,一方面可抑制其對(duì)促炎信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,也可以抑制其作為炎性細(xì)胞因子的下游信號(hào)中繼而介導(dǎo)的炎癥引發(fā)的有害效應(yīng),減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的引起的炎性反應(yīng);另一方面,可阻斷 p38-caspase-3促凋亡通路,減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。丹參組 p38 MAPK較模型組有所減低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示活血化瘀方藥丹參在抑制p 38 MAPK通路方面作用較弱,可能通過其他途徑抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,西藥組 p38 MAPK較獨(dú)活組有所下降,提示非甾類抗炎藥物可能在抑制p 38 MAPK的活性方面要優(yōu)于獨(dú)活。

綜上所述,當(dāng)聚集的Aβ蛋白刺激小膠質(zhì)細(xì)胞增生,產(chǎn)生一系列細(xì)胞毒性效應(yīng)后,機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性炎癥因子形成“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”,可引起廣泛的神經(jīng)細(xì)胞損害。由于炎癥因子及代謝產(chǎn)物數(shù)量眾多,僅針對(duì)其中某一種或幾種進(jìn)行干預(yù),往往達(dá)不到預(yù)期目的,因此通過阻斷封閉炎癥因子(如給予 IL-1Ra,TNF-R等)效果可能不十分理想。研究發(fā)現(xiàn)盡管炎癥因子數(shù)量眾多,但進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的信息通道卻為數(shù)較少,如能對(duì)其中關(guān)鍵的信號(hào)通路進(jìn)行有效阻斷和調(diào)節(jié),這對(duì)于調(diào)控炎癥因子及應(yīng)激蛋白的表達(dá),具有目標(biāo)明確,效果明顯的優(yōu)勢(shì)。p38 MAPK通路是參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號(hào)系統(tǒng)〔5〕。中藥獨(dú)活可抑制 p38 MAPK的活性,在信號(hào)通路水平阻斷和調(diào)控 p38 MAPK的表達(dá)和活性,從而抑制AD腦中的慢性炎癥反應(yīng),為中藥防治阿爾茨海默病提供了一條新的治療思路。

1 Irving EA,Barone FC,Reith AD,et al.Differential activation of MAPK/ERK and p38/MAPK in neurons and glia following focal cerebral ischemia in the rat〔J〕.Mol Brain Res,2004;77(1):65-75.

2 Legos JJ,Erhardt JA,White RF,et al.SB239063,a novel p38 inhibitor,attenuates early neuronal injury following ischemia〔J〕.Brain Res,2003;892(1):70-7.

3 Takagi Y,Nozaki K,Sugino T,et al.Phosphorylation of cJun NH2terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase after transient forebrain is chemia in mice〔J〕.Neurosci Lett,2000;294(2):117-20.

4 劉海霞,何 建.p38MAPK的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及相關(guān)疾病〔J〕.中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2003;23(12):883.

5 Bu XN,Huang P,Qi ZF,et al.Call type-specific actiuation mice〔J〕.Neurochem Int,2007;51(4):459-66.