急性淋巴細(xì)胞白血病患兒亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與甲氨蝶呤動(dòng)態(tài)血藥濃度相關(guān)性的研究

許 宏,張亞南,康熙雄*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心,北京100045)

白血病是兒童發(fā)病率較高的惡性腫瘤,其中以急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)最為常見,廣東省2003年-2004年0歲-18歲青少年惡性腫瘤流行病學(xué)調(diào)查,白血病位居第一位,年發(fā)病率1.36/10萬[1]。研究發(fā)現(xiàn)ALL與亞甲基四氫葉酸還原酶基因型突變相關(guān)[2].亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝途徑的限速酶,催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5甲基四氫葉酸,前者參與DNA合成和修復(fù),后者參與DNA甲基化。MTHFR基因研究較多的2個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)分別為MTHFR C677T和MTHFR A1298C,這兩種基因突變可導(dǎo)致MTHFR活性不同程度減低,進(jìn)而影響葉酸代謝。

甲氨蝶呤(methylaminopterin,MTX)是抗葉酸代謝藥物,大劑量甲氨蝶呤(high-dose methylaminopterin,HDMTX)是治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的主要治療藥物,尤其在維持治療及防治髓外白血病中有著極其重要的作用。臨床觀察治療過程中相同劑量的MTX用在不同個(gè)體時(shí)患者的療效和毒副反應(yīng)不同,不同的個(gè)體對(duì)MTX治療的敏感性及耐受性存在差異,推測(cè)葉酸代謝可能影響機(jī)體對(duì)MTX作用。本研究以ALL患兒為研究對(duì)象,探討MTHFR基因C677T和A1298C基因多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤化療期間的MTX動(dòng)態(tài)血藥濃度的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2009年6月-2010年2月在北京兒童醫(yī)院血液病房住院的初診并接受正規(guī)化療的ALL患兒35例,均經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)確診,其中男19例,女16例,年齡范圍在1.5歲-14歲之間,平均年齡5.5±3.6歲。35例患兒根據(jù)CCLG-ALL 2008方案臨床危險(xiǎn)度分為兩組:標(biāo)危組17例,其中男10例,女7例,年齡在2-7歲之間,平均年齡3.53±1.59歲。中危組18例,其中男9例,女9例,年齡范圍在1.5歲-14歲之間,平均年齡7.38±4.12歲?；熐把Ｒ?guī)、肝、腎功能均在正常范圍內(nèi)。所有患兒經(jīng)VDLD誘導(dǎo)方案治療處于完全緩解狀態(tài),應(yīng)用HD-MTX進(jìn)行鞏固及髓外白血病防治的治療。

1.2 HD-MTX用法 參見CCLG-ALL 2008方案,標(biāo)危組采用MTX 2.0 g/m2·次,中危組采用MTX 5.0 g/m2·次,1/6量(不超過500 mg/次)在 30 min內(nèi)快速靜脈滴入,余量在24 h內(nèi)均勻滴入?；熎陂g檢測(cè)血常規(guī)、肝、腎功能,并常規(guī)對(duì)口腔黏膜、胃腸道以及重要臟器進(jìn)行保護(hù)?；熀?2 h用甲酰四氫葉酸鈣(CF)15 mg/(m2·次)解救,每6 h給藥 1次,共6-8次。同時(shí)檢測(cè)血清MTX水平,以調(diào)整CF的應(yīng)用次數(shù)和劑量,直至血清MTX濃度＜0.1 μ mol/L時(shí),停止CF解救。

1.3 MTX藥物濃度監(jiān)測(cè) 經(jīng)HD-MTX治療預(yù)防髓外白血病患兒于靜脈滴注MTX后24 h、48 h、72 h采對(duì)側(cè)上肢靜脈血2 mL,應(yīng)用TDX熒光偏振免疫分析儀(FPIA,美國雅培公司)檢測(cè)MTX血藥濃度,MTX試劑由雅培公司提供。

1.4 外周血白細(xì)胞DNA提取 化療前抽取每個(gè)研究對(duì)象靜脈血2 ml,EDTA抗凝,提取外周血基因組DNA(愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)。

1.5 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增目的片段的引物分別是MTHFRC677T:F1 5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3'和F2 5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'[3];MTHFRA1298C位點(diǎn):F1 5'-CTT CTA CCT GAA GAG CAA GTC-3'和F2 5'-CAT GTC CAC AGC ATG GAG-3'[4](上海生工生物工程公司),產(chǎn)物分別為198 bp和256 bp。PCR反應(yīng)體系含有模板DNA、上游和下游引物、dNTP、緩沖液 (mg2+plus)、Ampli-Taq酶(TaKaRa公司)。MTHFR C677T的PCR反應(yīng)條件為:94℃4 min,94℃30 s、60℃60 s和 72℃60 s共 35個(gè)循環(huán),72℃10 min。MTHFR A1298C的PCR反應(yīng)條件為:94℃3 min,94℃30 s、56℃30 s、72℃60 s共35個(gè)循環(huán),72℃5 min。應(yīng)用MyCycler(BIO-RAD)儀器進(jìn)行PCR。

1.6 酶切鑒定 取PCR產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ(TaKaRa公司)或MboⅡ(TaKaRa公司)37℃溫浴2小時(shí),3%瓊脂糖凝膠電泳判定基因型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件?？ǚ綑z驗(yàn)比較不同基因型分布在性別和危險(xiǎn)度分組的差異,單因素方差分析比較HD-MTX化療后MTHFR不同基因型間MTX血藥濃度的差異,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因型鑒定

Hinf I識(shí)別MTHFR C677T突變T位點(diǎn),PCR產(chǎn)物酶切后共出現(xiàn)3種基因型(見圖1):野生型(CC)198 bp片段;純合變異型(TT)175 bp、23 bp片段;雜合變異型(CT)198 bp、175 bp及 23 bp片段。23 bp片段分子量太小,顯示不清楚。PCR產(chǎn)物經(jīng)Mbo II酶切后MTHFRA1298C出現(xiàn)3種基因型(見圖1):野生型(AA)有 176 bp 、30 bp、28 bp、22 bp 四個(gè)片段 ;純合變異型(CC)204 bp、30 bp、22 bp三個(gè)片段;雜合變異型(AC)有 204 bp、176 bp、30 bp、28 bp、22 bp 五個(gè)片段。30 bp、28 bp、22 bp片段分子量太小,顯示不清楚。

圖1 mthfr基因 RFLP分析圖

2.2 MTHFR基因型分布

35例ALL的MTHFR C677T基因型分布為:野生型(CC型)4例,突變雜合型(CT型)18例,突變純合型(TT型)13例。低危組:野生型(CC型)2例,突變雜合型(CT型)6例,突變純合型(TT型)9例,中危組:野生型(CC型)2例,突變雜合型(CT型)12例,突變純合型(TT型)4例。MTHFRA1298C基因型分布為:野生型(AA型)25例,突變雜合型(AC型)10例。低危組:野生型(AA型)13例,突變雜合型(AC型)4例,中危組:野生型(AA型)12例,突變雜合型(AC型)6例。MTHFR A1298C基因型CC型未見。最常見的基因型組合是C677 TT/A1298AA(25.71%)和C677 CT/A1298 AA(22.86%),未檢出C677 TT/A1298 AC基因型(見表1)。MTHFR C677T以及A1298C基因型分布在臨床分組未見差異(分別為P=0.142,P=0.521)。

表1 35例ALL患兒MTHFR基因型臨床分組

2.3 MTHFR基因突變比率

35例ALL患兒中MTHFRC677T CT+TT基因突變率占88.57%,MTHFR A1298C AC+CC基因突變率占28.57%(表1)。

2.4 MTHFR基因型與HD-MTX化療后動(dòng)態(tài)MTX濃度的關(guān)系

HD-MTX化療臨床危險(xiǎn)度分組標(biāo)危組和中危組的MTX動(dòng)態(tài)血藥濃度24 h與48 h、72 h有顯著差異(P=0.002)(見表2)。MTHFRC677T基因型24 h的MTX濃度有顯著差異(P=0.017)(表3),CT型明顯高于CC型及TT型(P=0.025,P=0.016);48 h、72 h的MTX濃度未見差異(見表3)。MTHFR A1298C基因型之間24 h,48 h,72 h的MTX濃度未見差異(P＞0.05)(見表3)。

表2 HD-MTX化療后血清MTX濃度(±s mol/L)

表2 HD-MTX化療后血清MTX濃度(±s mol/L)

*P＜0.05

時(shí)間(h)治療前 24 48 72臨床危險(xiǎn)度分組標(biāo)危組 0.01±0.0228.41±19.920.33±0.25 0.20±0.19中危組 0.02±0.0261.61±33.531.17±1.34 0.39±0.59 P值 0.79 0.002* 0.02 0.40

表3 HD-MTX化療后MTHFR基因型MTX動(dòng)態(tài)濃度(±s mol/L)

表3 HD-MTX化療后MTHFR基因型MTX動(dòng)態(tài)濃度(±s mol/L)

*P＜0.05

HD-MTX化療后時(shí)間(h)基因型 ±s mol/L P值MTHFR C677T 24 CC 21.93±15.91 0.017*CT 59.45±35.03 TT 30.69±18.41 48 CC 0.83±0.61 0.957 CT 0.72±1.06 TT 0.84±1.24 72 CC 0.28±0.18 0.984 CT 0.33±0.62 TT 0.35±0.36 MTHFRA1298C 24 AA 45.70±34.93 0.613 AC 38.96±20.39 48 AA 0.85±1.23 0.539 AC 0.60±0.45 72 AA 0.37±0.57 0.507 AC 0.21±1.48

3 討論

MTHFR是研究癌癥基因多態(tài)性較好的基因之一,研究發(fā)現(xiàn)突變頻率較高的兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是MTHFR C677T和A1298C。MTHFR基因多態(tài)性與急性淋巴細(xì)胞白血病的易感性是否相關(guān)尚有爭(zhēng)議。德國學(xué)者研究從1983到2003年出生人群未見MTHFR基因多態(tài)性與ALL相關(guān)[5]。但是,Sinnett研究MTHFR基因突變與ALL相關(guān),突變基因型可降低ALL風(fēng)險(xiǎn),具有保護(hù)作用[6],推測(cè)懷孕期間服用維生素的孕婦在各國之間的差異(從法國3%到美國90%)是影響研究結(jié)論的因素之一,即MTHFR與種族、地域、文化習(xí)慣等因素相關(guān)。MTHFR各基因型與ALL疾病相關(guān)程度也報(bào)道不一。我國學(xué)者江華等研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 677CT/TT等基因多態(tài)性對(duì)兒童ALL的發(fā)生具有保護(hù)作用,有可能使兒童ALL發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)降低3倍,而MTHFR A1298C的各種基因型則與兒童ALL的發(fā)生間均無明顯相關(guān)性[7]。de Jonge等未發(fā)現(xiàn)MTHFR A1298C基因?qū)LL發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有任何預(yù)防作用,而其他基因還原葉酸載體基因(reduced folate carrier gene,RFC1)和尼克酰胺N-甲基化酶(nicotinamide N-methyltransferase,NNMT)基因多態(tài)性可增加ALL發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。本研究對(duì)ALL患兒MTHFR基因多態(tài)性調(diào)查發(fā)現(xiàn):①M(fèi)THFR保護(hù)基因TT/AC和TT/CC及風(fēng)險(xiǎn)基因TT/AA和CT/AA。Thirumaran等[5]調(diào)查 460例ALL和1472例對(duì)照組沒有 TT677/AC1298和TT677/CC1298基因型,本研究ALL也未見這兩種基因型,提示這兩型基因可能是保護(hù)基因。而最多見基因型TT677/AA1298(25.71%)和CT677/AA1298(22.86%),提示這兩型基因與其他基因型比較患病風(fēng)險(xiǎn)較高。②ALL患兒MTHFR CT+TT突變頻率比成人ALL高。MTHFR C677T CT+TT占88.57%,MTHFR A1298C AC+CC占29%,患兒的MTHFRC677T基因突變型高于成人(65.1%)(P=0.019),MTHFRA1298C基因突變型與成人(28.6%)(P=1.000)相似[9]。③MTHFR基因多態(tài)性與臨床根據(jù)CCLG-ALL 2008方案將病情危險(xiǎn)度分組無差異(P＞0.05)?；蚨鄳B(tài)性與ALL病情嚴(yán)重程度無關(guān)。

關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與化療的敏感性及毒副反應(yīng)關(guān)系也有相關(guān)報(bào)道。余慧等研究發(fā)現(xiàn)具有MTHFR 677 CT突變的個(gè)體對(duì)于MTX化療的毒副反應(yīng)發(fā)生率較野生型明顯提高,前者的毒副反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為后者11.3倍[10]。劉晶霞等研究結(jié)果顯示HD-MTX化療對(duì)擁有MTHFR C677 TT等位基因患者的毒副作用高于攜帶MTHFR 677 TC等位基因的野生型基因型[9]。然而,Samart等發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T變異在ALL患兒接受HD-MTX治療時(shí)沒有增加MTX導(dǎo)致的毒性的風(fēng)險(xiǎn)性。MTHFR 1298CC基因型降低骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)性[11],A1298C與MTX毒副反應(yīng)相關(guān)[12]。本研究MTX用藥按照ALL診療建議臨床危險(xiǎn)度分組即標(biāo)危組和中危組用藥劑量不同,在化療期間,患兒肝功、腎功等檢測(cè)指標(biāo)均在正常參考范圍,未見基因多態(tài)性與MTX的毒副作用相關(guān),關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性對(duì)ALL患兒MTX毒副反應(yīng)的影響還有待更多病例調(diào)查和進(jìn)一步研究。HD-MTX化療期間MTX動(dòng)態(tài)血藥濃度研究中發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型24小時(shí)的MTX濃度有差異,CT型明顯高于CC型及TT型。MTHFR 677CT和TT突變基因型的酶比活性分別為677C/C基因型的60%和30%[3]且MTHFRC677T TT基因型存在DNA低甲基化[13],四氫葉酸還原酶酶活性降低使葉酸生產(chǎn)減少,導(dǎo)致體內(nèi)DNA甲基化異常,DNA甲基化異常影響MTX代謝,造成MTX在體內(nèi)代謝緩慢,推測(cè)TT型比CT型代謝慢。而本研究提示甲氨喋呤在MTHFR 677C/T型代謝較緩慢,推測(cè)可能是一個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)MTX代謝影響程度較大。

臨床用藥過程中觀察相同劑量的甲氨蝶呤用在不同的患者其毒副反應(yīng)不一,不同患者對(duì)此藥的敏感性和耐受程度不同,基因多態(tài)性在個(gè)體分布差異是造成臨床療效不同的原因之一。監(jiān)測(cè)MTX血藥濃度,根據(jù)血藥濃度作為調(diào)整甲酰四氫葉酸鈣解救MTX濃度調(diào)整CF的應(yīng)用次數(shù)和劑量,對(duì)MTX清除緩慢患兒尤為重要,保證療效和減少甲氨喋呤毒副作用。隨著葉酸代謝途徑的研究進(jìn)展,MTHFR基因多態(tài)性與ALL易感性關(guān)系的研究進(jìn)展,為ALL個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。臨床治療ALL前檢測(cè)MTHFR C677T基因型,預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)藥物敏感性,在HDMTX給藥和CF解救過程中監(jiān)測(cè)和及時(shí)調(diào)整MTX濃度進(jìn)行個(gè)體化治療。

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