林蛙卵油灌胃對于雄激素預(yù)處理大鼠婦科內(nèi)分泌的影響

苑春莉,孫連坤,康勁松

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,吉林 長春130021)

近年來的研究顯示由取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油能調(diào)節(jié)婦科內(nèi)分泌功能[1-3],本研究旨在通過動物實驗分析林蛙卵油對于紊亂的婦科內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 林蛙卵精油的提取

1.1.1 樣品采集 吉林省樺甸產(chǎn)成齡林蛙,當(dāng)年初冬捕獲,在剝?nèi)×滞苡偷耐瑫r取林蛙卵巢。

1.1.2 卵油的提取與精制 將林蛙卵巢自然晾干,除去雜質(zhì),用乙醇冷浸3次,過濾得卵渣,并減壓回收乙醇,再過濾除去少量沉淀物,又得淺黃棕色液體粗卵油。將卵渣再反復(fù)用乙醇浸泡,直至乙醇液基本無色,傾出乙醇,并干燥、粉碎。所得乙醇液仍在減壓下回收乙醇,卵油并入粗卵油中。粗卵油中加入2倍量的乙醇稀釋后,加入20%的中和劑(兼有脫水作用),攪拌均勻,放置1 h后過濾,減壓回收乙醇,即得黃棕色液體精制卵油。

1.2 雄激素處理模型的復(fù)制

選擇9日齡Wistar清潔雌性大鼠50只,其中模型組40只,丙酸睪丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射,建立丙酸睪丸酮誘導(dǎo)的大鼠模型;正常組10只,同期生理鹽水皮下注射。

1.3 動物實驗

1.3.1 分組 共計50只大鼠,分為5組,分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組,模型組和正常組,每組10只,前4組在造模成功后喂養(yǎng)110天至成年。模型組和正常組用生理鹽水3 ml/day灌胃;林蛙卵油各劑量組應(yīng)用林蛙卵油灌胃,劑量為1.0,0.4,0.1 g/day,用生理鹽水稀釋至3 ml,灌胃15天后處死大鼠。

1.3.2 觀察 在給予灌胃前即開始陰道涂片觀察陰道細胞的變化。處死前稱重,留取動脈血,立即離心留取血清。子宮和卵巢稱重。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測

雌二醇、FSH、孕酮放免試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,嚴(yán)格按照試劑盒說明進行實驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,各組檢測指標(biāo)用±s表示,以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 陰道脫落細胞改變

模型組陰道細胞涂片見到大量角化細胞,林蛙卵油灌胃后陰道細胞涂片見到有核上皮細胞,尤其在大劑量組見到的有核上皮細胞較多。說明給予林蛙卵油灌胃后大鼠表現(xiàn)出動情前期的變化,卵巢功能有恢復(fù)。

2.2 卵巢、子宮的大體觀察

模型組卵巢蒼白,表面可見少量的卵泡,且卵泡較小,亦可見極少量的黃體;子宮較小,色澤欠紅潤。正常組、林蛙卵油大、中、小劑量組大鼠卵巢色澤鮮紅,卵泡數(shù)目明顯多于模型組,卵泡明顯增大,表面見較多黃體;子宮外觀粗大發(fā)紫,子宮肌層明顯增厚。

2.3 卵巢鏡下觀察

新鮮黃體為體積較大又富有血管的內(nèi)分泌細胞團,是排卵后,卵泡壁連同血管一起向卵泡腔塌陷,腔內(nèi)可見凝固的血塊;成熟卵泡即大卵泡,體積較大,凸向卵巢表面,卵泡腔很大,有一明顯卵丘,可見清晰卵細胞;其余為小卵泡。模型組可見大量原始卵泡,卵泡多呈囊性擴張,顆粒細胞層次減少至1-2層,排列松散,卵細胞消失,內(nèi)含大量漿液性物質(zhì),生長卵泡數(shù)目較少,極少見黃體出現(xiàn)。而正常組可見各期卵泡及黃體組織,未見囊性卵泡。林蛙卵油大、中、小劑量組生長卵泡數(shù)目明顯增多,可見成熟卵泡及黃體,卵泡未見明顯的囊性擴張。

2.4 林蛙卵油對大鼠子宮、卵巢重量及與體重之比的影響

模型組子宮及卵巢重量明顯低于正常組(P＜0.01),而林蛙卵油各劑量均可明顯增加子宮及卵巢的重量(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯(見表1)。模型組卵巢體重之比明顯低于正常組(P＜0.05),而林蛙卵油各劑量均可明顯增加卵巢體重之比(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯。而林蛙卵油各劑量組對子宮體重之比沒有明顯影響(見表2)。

表1 林蛙卵油對大鼠子宮及卵巢重量的影響

表2 林蛙卵油對大鼠子宮及卵巢與體重之比的影響

2.5 血清學(xué)實驗結(jié)果

模型組大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量與正常對照組相比明顯降低(P＜0.05),而林蛙卵油各劑量組均能明顯提高大鼠體內(nèi)FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中劑量對體內(nèi)FSH含量增加最明顯,而林蛙卵油大劑量對體內(nèi)雌二醇含量增加最為明顯,林蛙卵油各劑量組對體內(nèi)孕酮含量的改變不明顯(見表3)。

表3 林蛙卵油對大鼠血清中激素水平的影響

3 討論

中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油的保健價值很高。彭飛等的研究證實林蛙卵油具有溫和的降低血脂,軟化血管,抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)特征、抑制血脂沉積作用[3];又有一定的中樞抑制作用[4,5],林蛙卵油具有明顯的增強機體抗脂質(zhì)過氧化損傷,調(diào)節(jié)免疫的抗衰老的生物作用[6],沒有明顯毒副反應(yīng),適合患者的用藥心理。

我們的研究發(fā)現(xiàn):模型組陰道細胞涂片見到大量角化細胞,林蛙卵油灌胃后陰道細胞涂片見到有核上皮細胞,尤其在大劑量組見到的有核上皮細胞較多。說明給予林蛙卵油灌胃后大鼠表現(xiàn)出動情前期的變化,卵巢功能有恢復(fù)。

處死大鼠后稱量大鼠體重、子宮重量和卵巢重量發(fā)現(xiàn):模型組子宮及卵巢重量明顯低于正常組,而林蛙卵油各劑量均可明顯增加子宮及卵巢的重量,尤其以林蛙卵油高劑量組增加的最為明顯。進一步觀察卵巢、子宮的大體結(jié)構(gòu)改變發(fā)現(xiàn):模型組卵巢蒼白,表面可見少量的卵泡,且卵泡較小,亦可見極少量的黃體;子宮較小,色澤欠紅潤。正常組、林蛙卵油大、中、小劑量組大鼠卵巢色澤鮮紅,卵泡數(shù)目明顯多于模型組,卵泡明顯增大,表面見較多黃體;子宮外觀粗大發(fā)紫,子宮肌層明顯增厚。結(jié)合光學(xué)顯微鏡下的觀察,正常組卵巢中可以觀察到新鮮黃體、成熟卵泡(即大卵泡)和小卵泡,未見囊性卵泡。模型組可見大量原始卵泡,卵泡多呈囊性擴張,顆粒細胞層次減少至1-2層,排列松散,卵細胞消失,內(nèi)含大量漿液性物質(zhì),生長卵泡數(shù)目較少,極少見黃體出現(xiàn)。林蛙卵油大、中、小劑量組生長卵泡數(shù)目較模型組明顯增多,可見成熟卵泡及黃體,卵泡未見明顯的囊性擴張。說明我們制做的雄激素模型可以表現(xiàn)出卵巢中卵泡囊狀擴張、不排卵進而不孕的生物學(xué)行為,所以這種模型被作為不孕癥或者多囊卵巢綜合癥的實驗研究模型,在排卵功能上和形態(tài)學(xué)上代表了兩種疾病的最關(guān)鍵的表型,給予初生大鼠大劑量雄激素可以使成年大鼠的卵巢損傷,表現(xiàn)在卵巢萎縮,生長卵泡數(shù)量減少和排卵功能的缺失。給予林蛙卵油灌胃后對于這種卵巢損傷有糾正作用,卵巢形態(tài)學(xué)上恢復(fù)正常卵巢的狀態(tài),黃體的出現(xiàn)說明排卵功能的恢復(fù)。

我們進一步研究了各組大鼠血清中的雌激素、促卵泡激素和孕酮的含量。發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量與正常對照組相比明顯降低,而林蛙卵油各劑量組均能明顯提高大鼠體內(nèi)FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中劑量對體內(nèi)FSH含量增加最明顯,而林蛙卵油大劑量對體內(nèi)雌二醇含量增加最為明顯,林蛙卵油各劑量組對體內(nèi)孕酮含量的改變不明顯。這一結(jié)果可以用雌激素在下丘腦-垂體-卵巢軸中的反饋調(diào)節(jié)作用來解釋:雌激素對于下丘腦分泌的GnRH和垂體分泌的促性腺激素(促卵泡激素FSH和促黃體激素LH)的合成和分泌具有反饋調(diào)節(jié)作用。小劑量雌激素對下丘腦產(chǎn)生負反饋,抑制GnRH的分泌,減少垂體的促性腺激素的分泌;大劑量雌激素既可以產(chǎn)生正反饋,又可以產(chǎn)生負反饋,排卵前大量產(chǎn)生的雌激素刺激下丘腦GnRH和垂體FSH、LH的大量釋放,而排卵后血清中大量的雌激素與孕激素協(xié)同作用,FSH、LH的分泌又受到抑制。我們的實驗結(jié)果充分說明,林蛙卵油對于卵巢的保護作用有效的作用成分可能是雌激素:初生期給予雄激素抑制了下丘腦-垂體-卵巢軸的發(fā)育,我們測定的多個激素(FSH、E、P)均處于低水平,而給予林蛙卵油灌胃后,補充了外源性雌激素,提高了血清中的雌激素水平,大劑量的雌激素對于下丘腦和垂體產(chǎn)生正反饋作用,刺激FSH水平升高,由于單純的雌激素作用沒有引致大量排卵,缺乏孕激素的協(xié)同作用,所以負反饋作用對于FSH分泌的抑制不明顯。至于中劑量組較高劑量組FSH升高明顯的機制,尚待對于林蛙卵油成分的進一步認識。

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