ADMA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能影響的體外研究

趙 雷,張吉鳳,趙佳怡,祝金明,李淑梅*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所;3.吉化總醫(yī)院心血管內(nèi)科)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是危害人類健康的最常見疾病之一,多項(xiàng)研究證實(shí)AS的始動(dòng)及關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種重要的血管活性物質(zhì),具有舒張血管,減弱氧自由基產(chǎn)生、低密度脂蛋白氧化等抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的作用,NO合成障礙勢(shì)必促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展。不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)是內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制劑,通過影響NO合成而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[1],因此與冠心病形成密切相關(guān)。本研究觀察了ADMA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響,旨在探討其作為一個(gè)新的獨(dú)立預(yù)測(cè)冠心病危險(xiǎn)事件的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

ADMA標(biāo)準(zhǔn)品,純度,99.99%(Sigma公司),M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibico公司),胎牛血清(杭州四季青有限公司)、PE標(biāo)記小鼠抗人ICAM-1抗體、APC標(biāo)記小鼠抗人VCAM-1抗體(BD公司),NO檢測(cè)試劑盒(南京聚力生物有限公司),其它為市售試劑。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 用0.1% Ⅱ型膠原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將狀態(tài)良好的用新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,再用0.25%胰蛋白酶消化制成單個(gè)細(xì)胞懸液,以5×104/孔接種到24孔板中,對(duì)照組加含0.9%氯化鈉培養(yǎng)液,ADMA組加分別含有5 μ mol/L和10 μ mol/L的培養(yǎng)液。每組設(shè) 5復(fù)孔,培養(yǎng) 48 h后進(jìn)行數(shù)量和功能測(cè)定。

1.2.3 細(xì)胞粘附能力的測(cè)定 在倒置相差顯微鏡下隨機(jī)挑選10個(gè)視野(x100倍)計(jì)數(shù)各組貼壁梭形細(xì)胞數(shù)后,用0.25%胰蛋白酶消化后制成單個(gè)細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后等量接種到48孔培養(yǎng)板,5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h,洗去各孔未貼壁細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下隨機(jī)挑選10個(gè)視野(×100倍)計(jì)數(shù)各組重貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 NO含量的測(cè)定 采用Griess重氮法反應(yīng)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO的濃度。吸取各組每孔培養(yǎng)液100 μ l加入到96孔培養(yǎng)板中,再依次加Griess ReagentⅠ、Ⅱ,混勻,15分鐘后用722分光光度計(jì)570 nm處測(cè)A值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)

分別取1×106各組HUVECs,用 PBS-2%FBS洗 1次,用100 μ l PBS-2%FBS制成單個(gè)細(xì)胞懸液。分別加入適量PE標(biāo)記小鼠抗人ICAM-1抗體和APC標(biāo)記小鼠抗人VCAM-1抗體,室溫避光孵育15 min。各組細(xì)胞加入2.5 ml PBS-2%FBS,300 g離心10 min。重懸細(xì)胞在250 μ l PBS-2%FBS中于流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示,各組之間的比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADMA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)形態(tài)和數(shù)目的影響

對(duì)照組HUVECs在培養(yǎng)48 h后成梭形內(nèi)皮細(xì)胞樣,貼壁良好。ADMA不同劑量組細(xì)胞粘附能力明顯降低,細(xì)胞形態(tài)亦發(fā)生改變(見圖1)。與對(duì)照組相比,ADMA可明顯降低貼壁細(xì)胞的數(shù)量,且成劑量依賴性(見表1)。

表1 ADMA對(duì)HUVECs粘附細(xì)胞數(shù)量的影響

2.2 ADMA對(duì)HUVECs培養(yǎng)上清中NO含量的影響

與對(duì)照組相比,ADMA可明顯降低NO的生成(P＜0.01)。ADMA不同劑量組之間的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖1)。

2.3 ADMA對(duì)HUVECs粘附分子表達(dá)的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,ADMA可明顯增強(qiáng)HUVECs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。與對(duì)照組相比,ADMA各劑量組ICAM-1和VCAM-1分子的表達(dá)量均有顯著性差異(P＜0.01),ADMA不同劑量組VACM-1表達(dá)量的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表2)。

圖1 ADMA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清NO含量的影響

表2 ADMA對(duì)HUVECs粘附分子表達(dá)的影響(%)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素所致的動(dòng)脈血管慢性疾病,集中表現(xiàn)為全身性血管內(nèi)皮功能障礙、血管內(nèi)膜慢性炎癥、纖維增生、管腔狹窄及血栓形成等。近來研究表明,伴隨以NO生物利用度降低為主要生化表現(xiàn)的血管內(nèi)皮功能障礙是促使AS發(fā)生的始動(dòng)因素。ADMA作為內(nèi)源性NOS的抑制劑,通過減少NO合成導(dǎo)致內(nèi)皮功能不全,因此ADMA與AS的發(fā)病密切相關(guān)[2-4]。Rainer等[5]證實(shí)高膽固醇血癥家兔的血漿中ADMA濃度明顯升高,而NO的含量明顯降低。Cooke[6]等在對(duì)高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化患者的血清檢測(cè)中得到相似的結(jié)果。本研究結(jié)果證實(shí)不同劑量ADMA對(duì)HUVECs細(xì)胞產(chǎn)生的NO有明顯抑制作用,且成劑量依賴性。同時(shí),ADMA可明顯降低HUVECs的數(shù)目和粘附性能,并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)有所改變。因此可以認(rèn)為高水平的ADMA濃度是HUVECs功能受損的原因之一。

細(xì)胞粘附分子(CAM)是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附及信號(hào)傳到作用的糖蛋白,其如何參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[7,8]。有研究證明ICAM-1、VCAM-1是介導(dǎo)白細(xì)胞向血管內(nèi)皮附壁游走和向內(nèi)膜下浸潤(rùn)的主要分子之一,在AS形成過程中病變部位血管內(nèi)皮二者的表達(dá)水平與病變的嚴(yán)重程度成正比[9]。CAM促進(jìn)AS形成的機(jī)制與其增強(qiáng)循環(huán)血中單個(gè)核細(xì)胞粘附在血管內(nèi)膜表面并遷移至血管壁,吞噬脂質(zhì)形成斑塊有關(guān)。本研究結(jié)果顯示在ADMA的作用下,HUVECs細(xì)胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)水平明顯增高,提示促進(jìn)粘附分子的表達(dá)可能為ADMA引發(fā)AS的機(jī)制之一。

AS是多種病因造成的始發(fā)于動(dòng)脈壁內(nèi)膜的一系列復(fù)雜分子和細(xì)胞改變的總結(jié)果,血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附特性的改變?cè)趨⑴cAS發(fā)生發(fā)展的作用仍需從分子水平、基因調(diào)控等方面進(jìn)一步研究闡明。

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