IGF-1a的克隆與表達

賈贊慧,鄭桂英,崔滿華*,孫 琳,范艷艷

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林長春130041;2.吉林大學(xué)化學(xué)系;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

胰島素樣生長因子-1(IGF-1a)在多種腫瘤組織中均呈高表達狀態(tài),這種表達與腫瘤的分化程度、預(yù)后有關(guān)[1]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞合成和表達的IGF-1a參與子宮內(nèi)膜的增生和分化以及淋巴轉(zhuǎn)移[2]。在進行IGF-1a與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系研究過程中,需要提供大量IGF-1a蛋白質(zhì),本實驗采用用分子克隆技術(shù)正確克隆及表達IGF-1a,為探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療中的意義提供實驗室基礎(chǔ),現(xiàn)將該基因的克隆、表達及純化過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 NcoⅠ和 XhoⅠ內(nèi)切酶購自TakaRa公司;Taq DNA 聚合酶 、dNTP、oligo-dT、10 ×PCR緩沖液、T4連接酶購自美國 Promega公司;RNase、卡那霉素及氨芐青霉素購于華美生物工程公司;IPTG購自Sigma公司。pET表達系統(tǒng)購自美國Novagen公司。pMD18-T vector購自TakaRa公司;大腸桿菌菌種BL21由本室保存。DNA marker購自華美生物工程公司,引物由上海生物工程公司合成。

1.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的構(gòu)建①IGF-1a基因的獲取:用所合成的引物進行五重PCR擴增,五對引物為:第一對引物共設(shè)計5對引物,各對引物順序均從 5'到3',第一對引物GCTCTTCACTTCGTGTGTCGACCGAGGGGCTTTTACTTC AACAAGCCCACAGGCTATG(58 bp)和CACTCATCCACAATCCCTGTCTGAGGTGCCCTCCGAATGCTGGAGCCA TAGCCTGTGG(58 bp);第二對引物CACTACAGCCGGACCAGAGACCCTTTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCT CTTCACTTC( 58 bp)和CACAGTACATCTCCAGTCTCCT CAGATCACAGCTCCGGAAGCAACACTCATCCACAATC-(58 bp);第三對引物為CACACCTGTTCTACCTGGCGTCTGCTTGCTCACCTTCACCAGCTCCACTACAGCCCGG(58 bp)和GTTGGGCACGGATAGAGCGGGCTGCTTTTGTAGGCTTCAGTGGGGCACAGTACATCTC(58 bp);第四對引物CTGCCTCTGTGACTTCTTGAAGATAAAGATACACATCATGTCGTCTTCACACCTGTTC(58 bp)和TTCAAATGTACTTCCTTCTGAGTCTTGGGCATGTCAGTGTGGCGTTGGGCACGGATAG (58 bp);第五對引物CCATGGGGAAAATCAGCAGCCTTCCAACTCAATTATTTAAGATCTGCCTCTGTGAC(56 bp)和CTCGAGCATTC-TGTAGGTCTTGTTTCCTGCACTTCCTCTACTTGTGTTCTTCAAATGTACTTC(63 bp)。②pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的獲得:將PCR擴增出的產(chǎn)物片段以NcoI和XhoI切點定向克隆入pET28a表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。取經(jīng)卡那霉素平板篩選的陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng),提取質(zhì)粒。采用相同酶切后,用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆。然后由上海生物工程公司對重組質(zhì)粒進行測序鑒定。

1.3 IGF-1a的表達和純化 ①陽性重組克隆的篩選:將pET28a轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)涂于含卡那霉素的LB平板上。分別挑取單克隆,加人適量的LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)過夜,用堿裂解法制備質(zhì)粒,pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒用NcoI和XhoI雙酶切及2%瓊脂糖凝膠電泳對陽性克隆進行鑒定,釋放出長度約為481 bp的片段的菌落為陽性重組克隆。利用載體多克隆位點的上游序列設(shè)計測序引物,由本室AB1310DNA序列自動分析儀進行測序鑒定。②表達:挑取含pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒的單菌落,生長于含有50 g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。菌液在三角燒瓶中于37℃、200 r/min的恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)至A600值為0.5-1.0,然后用0.1%IPTG于37℃誘導(dǎo)3 h。離心收集菌體進行SDSPAGE分析,在相對分子質(zhì)量約15 kd的位置上有明顯表達條帶的為陽性克隆。③表達產(chǎn)物的純化:離心收獲大腸桿菌并將其懸于含2 mmol/L PMSF的溶液中,超聲破碎裂菌。將細(xì)菌裂解液裝人鎳離子鰲合瓊脂糖凝膠-4B柱上。層析柱用1%Tritonx-100充分洗滌以去除內(nèi)毒素,被結(jié)合的蛋白質(zhì)用50 mmol/L的咪唑洗脫,然后用Q-瓊脂糖凝膠柱進一步純化,貯存于-70℃。通過SD-SPAGE和凝膠掃描儀分析純度。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

第1個PCR應(yīng)合成104 bp片段,第2個PCR應(yīng)合成194 bp片段,第3個PCR應(yīng)合成285 bp片段,第4個PCR應(yīng)合成378 bp片段,第5個PCR應(yīng)合成481 bp片段,5次PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與實際堿基對數(shù)相符,見圖1。

2.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒NcoⅠ和XhoⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

在1 000-2 000 bp可見一條明亮電泳帶,與實際堿基對數(shù)(467 bp)相符,見圖2。上海生物工程公司測序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒中IGF-1堿基序列正確。

2.3 IGF-1蛋白表達純化產(chǎn)物SDS-PAGE

重組蛋白的表達量可以達到菌體蛋白的60%以上;純化后重組蛋白的純度可達 98%以上,見圖3。

圖1 IGF-1 5重PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 2%瓊脂糖凝膠電泳分析

圖3 IGF-1a蛋白表達純化產(chǎn)物圖

3 討論

近年來IGF-1a在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用上的重要性倍受關(guān)注。國內(nèi)外有多家實驗室開展了重組IGF-1a的研制工作,所用的克隆方法及表達系統(tǒng)也各不相同,既有大腸桿菌原核表達系統(tǒng),也有酵母或哺乳動物細(xì)胞等真核表達系統(tǒng)[3,4]

本研究通過多重PCR方法成功克隆了IGF-1a目的基因,并構(gòu)建了pET28a-Cpn10-IGF-1a重組質(zhì)粒,實現(xiàn)了外源蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達,通過SDS-PAGE電泳分析表明,該外源蛋白是IGF-1a基因的表達產(chǎn)物,并且通過鎳金屬鰲合親和層析,獲得了高純度的目的蛋白。

多重PCR(multiplex PCR)是在同一試管中加入多對引物,擴增同一模板的幾個區(qū)域,可一次性篩選出目的DNA,具有檢測的覆蓋面較廣、效率較高、費用相對較低等優(yōu)點[5],本研究選用的大腸桿菌原核表達系統(tǒng)在基因表達技術(shù)中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛,與其他系統(tǒng)相比具有遺傳背景清楚、繁殖快、表達效率高及抗污染能力強[6],提高目的蛋白表達量,方便下游蛋白純化等優(yōu)點[7]。pET28a(+)原核表達載體含有能被T7 RNA聚合酶特異性識別的T7強啟動子[8]。將外源基因置于T7啟動子控制下,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠高效表達外源蛋白。從圖3可以看出,重組蛋白的表達量可以達到菌體蛋白總量的60%以上,重組蛋白的純度可達98%以上,完全能滿足下游實驗的要求,從而為探索IGF-1與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[2]研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

[1]吳君心,余子豪,鄭天榮,等.胰島素樣生長因子受體與乳腺癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2000,9:91.

[2]O'TOOLE S A,DUNN E M.Oestrogen regulated gene expression in nomal and malignant endometrial tissue[J].Maturitas,2005,51(2):187.

[3]岳鳳鳴,趙煥英,楊 慧,等.F人胰島素樣生長因子89基因的克隆表達和活性檢測[J].解剖學(xué)報,2003,34(3):306.

[4]賴心田,周 鵬,洪 葵.人胰島素樣生長因子1在畢赤酵母中表達的研究[J].藥物生物技術(shù),2002,9(3):133.

[5]Verhagen OJ,Willemse MJ,Breunis WB,et al.Application of germline IGH probes in real time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2000;14:1426.

[6]李育陽.基因表達技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:1-13.

[7]Yoon S J,Park JW,Ahn SYetal.DNA-mediated immunization of mice with plasmid encoding HBs antigen[J].J Korean Med Sci,1999,14(2):187.

[8]陳長征,段治軍,楊新穎,等.T7啟動子控制下的多功能大腸桿菌表達系統(tǒng)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1996,28(5):531.