初步建立武漢地區(qū)健康成人血漿Cystatin C生物參考區(qū)間

李輝軍,管 青,周 丹

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢430030;2.廣州市金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,廣東廣州510000)

Cystatin C是一種低分子量的非糖基堿性分泌蛋白,分子量為13 KD,等電點(diǎn)為9.3,含有120個(gè)氨基酸殘基,是一種非糖基化的橢圓形小分子蛋白,其前體分子尚含有26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。Cystatin C廣泛分布于細(xì)胞外液,如腦脊液、血液、精液、唾液及胸水等。有研究表明,Cystatin C在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生速率恒定,不受炎癥、感染、腫瘤及肝功能等因素影響[1],完全經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò),由近曲小管重吸收和降解。血漿Cystatin C比BUN、Scr更能反映腎小球?yàn)V過(guò)率的水平[2],另國(guó)內(nèi)有報(bào)道Cystatin C指標(biāo)是評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)率快速、精確、簡(jiǎn)便的有效方法[3]。

我們根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)C28-A2文件[4]提供的建立生物參考區(qū)間的推薦方法,嘗試確立武漢地區(qū)健康成人血漿半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的生物參考區(qū)間。為臨床評(píng)價(jià)其臨床意義提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 選取480例體檢健康者肝素抗凝血漿,按不同年齡性別分為四個(gè)亞組,每個(gè)亞組120例,各組性別及年齡分布見(jiàn)表1。

表1 樣本分組情況

1.2 方法 儀器為Abbott Aeroset全自動(dòng)生化分析儀,試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品由北京利得曼公司提供;用顆粒增強(qiáng)散射免疫比濁法測(cè)定,按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。在測(cè)定樣本之前,對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)精密度進(jìn)行驗(yàn)證,使用同一質(zhì)控品連續(xù)4天進(jìn)行測(cè)定,每天平行測(cè)定5次,SD 0.02,CV值2.74%,驗(yàn)證可靠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 收集120例健康參考個(gè)體,進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果先做離群點(diǎn)的判斷:將疑似離群點(diǎn)和其相鄰點(diǎn)的差值(D)和數(shù)據(jù)全距(R)相除,D/R應(yīng)≤1/3,超出1/3考慮為離群點(diǎn)。若有2個(gè)或以上疑似離群點(diǎn),將最小的疑似離群點(diǎn)如上作處理,若大于1/3,則所有點(diǎn)都剔去;若小于1/3,則保留所有數(shù)據(jù)。若有離群點(diǎn)被剔除后,應(yīng)即將其他數(shù)據(jù)補(bǔ)上。繪制分布圖,了解數(shù)據(jù)的分布特性。若有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布可按±1.96 s表示95%數(shù)據(jù)分布范圍,若數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布則用百分位數(shù)法確定參考限(2.5%和97.5%百分位數(shù)),以此確定參考區(qū)間。若文獻(xiàn)資料顯示或臨床提供信息提示檢驗(yàn)項(xiàng)目是否存在生物差異,此時(shí)作Z檢驗(yàn)確定分組后的均值有無(wú)差異。

2 結(jié)果

對(duì)各亞組數(shù)據(jù)做簡(jiǎn)單的初步統(tǒng)計(jì),計(jì)算其均值,標(biāo)準(zhǔn)差,繪制分布圖,并使用軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),計(jì)算其sig值。本實(shí)驗(yàn)各亞組數(shù)據(jù)均無(wú)離群值且呈正態(tài)分布(sig＞0.05),其具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表2。各亞組數(shù)據(jù)分布如圖1-圖4。

表2 各個(gè)亞組統(tǒng)計(jì)情況

圖1 18-50歲女性組

圖2 50歲以上女性組

圖3 18-50歲男性組

圖4 50歲以上男性組

根據(jù)C28-A2文件準(zhǔn)則,多個(gè)亞組均數(shù)比較,應(yīng)進(jìn)行比Z檢驗(yàn)更進(jìn)一步的均數(shù)檢驗(yàn)。用SPSS 11.5軟件進(jìn)行 one-way ANOVA檢驗(yàn),P=0.000＜0.05(95%置信水平),各組均數(shù)不齊,進(jìn)一步進(jìn)行18-50歲女性和男性組以及50歲以上女性組和男性組的均數(shù)比較得出:健康人群中,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩個(gè)年齡段內(nèi),不同性別組之間,男性血漿中Cystatin C含量平均水平高于女性,但P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再進(jìn)行18-50歲女性組和50歲以上的女性組,18-50歲男性組和50歲以上的男性組的數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)比較。結(jié)果表明:50歲以上的女性組和男性組血漿中Cystatin C含量高于18-50歲的同性別組,P＜0.05(95%置信水平),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表3。

表3 各個(gè)亞組相互比較的P值(t檢驗(yàn))

因此,在95%置信水平下,Cystatin C生物參考區(qū)間應(yīng)該根據(jù)不同年齡分別確定,將相同年齡段內(nèi)不同性別組數(shù)據(jù)合并,進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)和均數(shù)t檢驗(yàn)。具體統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表4。

表4 性別組合并后的檢驗(yàn)結(jié)果

合并后的兩組數(shù)據(jù)仍然呈正態(tài)分布(sig＞0.05),對(duì)其進(jìn)行 t檢驗(yàn),P=0.014,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其分布圖如圖5、圖6。

且Z=18.398,Z*=4.243,Z＞Z*,應(yīng)該分組確立生物參考區(qū)間。18-50歲人群95%水平雙側(cè)生物參考區(qū)間為0.55-0.93 mg/L,而50歲以上人群95%水平雙側(cè)生物參考區(qū)間為0.88-1.19 mg/L。

圖5 18-50歲組

圖6 50歲以上組

3 討論

生物參考區(qū)間是臨床判斷健康與否的標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)室必須保證給臨床提供的生物參考區(qū)間正確適用,否則可能會(huì)導(dǎo)致誤診,甚至錯(cuò)誤的治療。建立各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自己的生物參考區(qū)間意義重大,但是按照國(guó)際化學(xué)委員會(huì)提出的方法[5],每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)建立適用于本實(shí)驗(yàn)室的臨床檢測(cè)項(xiàng)目的生物參考區(qū)間,在引用試劑說(shuō)明書(shū)或其它書(shū)刊文獻(xiàn)提供的或轉(zhuǎn)移其它實(shí)驗(yàn)室的生物參考區(qū)間之前,必須對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,以確保適用于本實(shí)驗(yàn)室。所用方法、儀器、試劑以及整個(gè)檢測(cè)系經(jīng)驗(yàn)記可靠[6,7]。

根據(jù)NCCLS C28-A2文件推薦的方法,在進(jìn)行儀器性能驗(yàn)證并合格之后,檢測(cè)各個(gè)亞組健康成人肝素抗凝血漿Cystatic C濃度。得到測(cè)定結(jié)果之后,先對(duì)各個(gè)亞組的數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析,包括正態(tài)性檢驗(yàn),均數(shù),SD等。然后按照文件的要求剔除離群值,并分析各組數(shù)據(jù)是否具有差異,再判斷臨床應(yīng)用時(shí),是否需要分組確定其生物參考區(qū)間。文件中指出,如果僅有兩個(gè)亞組,即可用Z檢驗(yàn)或者比較S值來(lái)進(jìn)行是否分組的判斷,但如果有兩個(gè)以上亞組,則建議參考專(zhuān)業(yè)人士意見(jiàn),并用如SPSS的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。本次試驗(yàn)分為四個(gè)亞組,即18-50歲女性和男性組,50歲以上女性和男性組。每個(gè)亞組的數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布,四組數(shù)據(jù)均數(shù)不齊,進(jìn)一步檢驗(yàn)得知,各年齡段內(nèi),不同性別組之間數(shù)據(jù)分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,將性別組合并成為兩個(gè)亞組,經(jīng)檢驗(yàn)合并后的亞組數(shù)據(jù)也呈正態(tài)分布,兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且Z檢驗(yàn)支持分組確立生物參考區(qū)間。根據(jù)文件中所述,如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布,則以±1.96 s確定其參考區(qū)間,否則,以2.5%和97.5%位數(shù)決定。本實(shí)驗(yàn)以±1.96 s的方式嘗試建立湖北武漢地區(qū)健康成人血漿Cystatin C濃度生物參考區(qū)間。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)初步得出的結(jié)果,本地區(qū)相同年齡段健康成人男性血漿Cystatin C濃度要高于女性,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而不同年齡段間健康成人血漿Cystatin C濃度存在顯著差異,這與國(guó)外Groesbeck DK 、Ichihara K、Galteau MM 、Finney H[8-11]等人的研究相類(lèi)似,本實(shí)驗(yàn)室采用的方法科學(xué)、規(guī)范,雖然得出的結(jié)果最終與試劑說(shuō)明書(shū)提供的生物參考區(qū)間存在一定差異,但經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室半年多的臨床驗(yàn)證,與臨床相符性良好,需要注意的是,本研究亦存在一定的局限性,如未對(duì)50歲以上老年人更進(jìn)一步的按年齡段分組,未考慮生活習(xí)慣如吸煙飲酒等影響因素對(duì)血漿Cystatin C濃度的影響。

[1]Randers E,Erlandsen EJ.Serum Cystatin C as endogenous maker of the renal function-a review[J].Clin Chem Lab Med,1999,37(4):389.

[2]Dhamidharka VR,Kwon C,Stevens G.Serum Cystatin C is superior to serum creafinine as a marker of kidney function:ameta-analysls[J].Am J Kidney Dis,2002,40(2):221.

[3]裘曉蕙,鐘光輝,陳 巍,等.應(yīng)用血清西司他汀濃度測(cè)定腎小球?yàn)V過(guò)率的相關(guān)研究[J].中華腎臟病雜志,2001,17(1):35.

[4]National Committee for Clinical Laboratory standards.How to Define and Reference Intervals in the Clinical Laboratory[S].Wayne,PA:C282A2,NCCLS,2000.

[5]Solberg HE,Stamm D.International Federation of Clinical Chemistry IFCC.IFCC recommendation 2 theory of reference values.Part 4.Control of analytical varia2 tion in the production,transfer and application of reference values[J].Clin Chim Acta,1991,202(122):S52S11.

[6]Michele Mussap,Nicoletta Ruzzante,Mariacristina Varagnolo,et al.Quantitative automated particla-enhanced immunonephe lometric assay for the routinary measurement of human cystatin C[J].Clin Chem Lab Med,1998,36(11):859.

[7]賈寧人,吳家明,芮志蓮,等.顆粒增強(qiáng)免疫透射比濁測(cè)定血中Cyst C全自動(dòng)分析法的建立與評(píng)價(jià)[J].放射免疫學(xué)雜志,2006,19(5):424.

[8]Groesbeck DK,Ttgen A,Parekh R,et al.Age,gender,and race effects on cystatin C levels in US adolescents[J].Clin J Am Soc Nephrol,2008,3(6):1777.

[9]Ichihara K,Saito K,Itoh Y.Sourcesof variation and reference intervals for serum cystatin C in a healthy Japanese adult population[J].Clin Chem Lab Med,2007,45(9):1232-6.

[10]Galteau MM,Guyon M,Gueguen R,et al.Determination of serum cystatin C:biological variation and reference values[J].Clin Chem Lab Med,2001,39(9):850.

[11]Finney H,Newman DJ,Price CP,Adult reference ranges for serum cystatin C,creatinine and predicted creatinine clearance[J].Ann Clin Biochem,2000,37(Pt 1):49.