大鼠坐骨神經(jīng)移植術(shù)后BDNF在脊髓內(nèi)表達的實驗研究

徐明珠,王悅書,孫鴻斌,崔樹森

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手外科,吉林長春130033)

BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,已有研究證實它對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運動神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、維持和損傷修復(fù)具有重要作用[1]。周圍神經(jīng)損傷作為神經(jīng)元損傷一部分,BDNF是否在移植修復(fù)過程中發(fā)揮作用是值得探討的問題。作者通過建立大鼠的自體神經(jīng)移植模型,觀察脊髓前角細胞內(nèi)BDNF的定位表達及其變化,以進一步解析BDNF在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性Wister大鼠60只,體重250-300 g(吉林大學(xué)動物實驗室),隨機分為對照組(假手術(shù)組)及實驗組(坐骨神經(jīng)移植組),每組各30只。各組按手術(shù)后3天、1周、2周、4周、6周、8周分為6個時間點,每個時間點各5只。主要試劑:兔抗鼠BDNF抗體(Santa Cruz公司),SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德)。使用濃度及方法嚴(yán)格按照說明書配置

1.2 模型制備與取材

10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉大鼠,右側(cè)臀部術(shù)區(qū)常規(guī)脫毛消毒,取斜行切口,切開皮膚,分離臀肌顯露坐骨神經(jīng)。對照組僅暴露坐骨神經(jīng)后閉合切口。實驗組于梨狀肌下緣及其以遠15 mm處分別切斷坐骨神經(jīng),在12倍手術(shù)顯微鏡下,兩處斷端用11-0無損傷線行外膜縫合,制成神經(jīng)移植模型。術(shù)后大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)。

取材:對不同時間點大鼠在腹腔麻醉下開胸暴露心臟,左心室插入導(dǎo)管,先用生理鹽水100 ml沖洗,再用含4%多聚甲醛緩沖液(pH=7.3)液灌注固定,待右心耳流出澄清灌注液時停止灌注,取L4-L6節(jié)段脊髓置于上述固定液內(nèi)固定18-24 h后,經(jīng)脫水,石蠟包埋,制成厚度為5 μ m的連續(xù)橫斷切片備用。

1.3 免疫組化的方法

切片進行脫蠟、水化后置于PBS洗3次各5分鐘;然后將過氧化物酶滴在每張切片上,室溫靜置10 min以滅活內(nèi)源性酶?？乖迯?fù):電爐或者水浴鍋加熱0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右,放入組織加熱10 min。滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體。滴加兔抗鼠BDNF(1∶50Santa)50 μ l,室溫靜置4℃過夜 。之后需在37℃復(fù)溫45 min。然后按照SP試劑核說明書使用。DAB顯色5-10 min,在顯微鏡下掌握染色程度;PBS終止反應(yīng);最后脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理 所得切片經(jīng)放大400倍,隨機選4個視野,測定BDNF陽性反應(yīng)細胞的平均灰度值,得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0軟件包進行單因素方差分析,并做組間均數(shù) t檢驗,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

400倍鏡下觀察L4-L6脊髓切片發(fā)現(xiàn),正常對照組各時相大鼠腰段脊髓中前角運動神經(jīng)元均有少量BDNF表達,胞漿為淡黃色,各時相無明顯變化(圖1-1);實驗組中脊髓運動神經(jīng)元BDNF陽性表達以胞漿為主,染色為棕黃色顆粒,其細胞邊界清楚,著色均勻。在術(shù)后3天-1周(圖1-2、1-3),BDNF表達就開始增高并持續(xù)到術(shù)后2周(圖1-4),表達呈現(xiàn)強陽性達高峰,在術(shù)后4周(圖1-5)表達有衰減,6周-8周(圖1-6)逐漸衰減但仍高于正常對照組的表達。統(tǒng)計學(xué)分析表明術(shù)后2周、4周、6周、7周、8周,兩組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,表1)。

圖1 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在脊髓前角中的免疫組化表達(×40)

表1 不同時相脊髓中BDNF陽性細胞的灰度值(n=5,±s)

表1 不同時相脊髓中BDNF陽性細胞的灰度值(n=5,±s)

*P＜0.05:與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

3 d 1w 2w 4 w 6 w 8 w對照組 121.20±2.78 122.66±2.64 121.02±3.03 117.77±3.51 118.95±4.68 119.40±2.34實驗組 124.18±2.75 126.83±4.30 165.23±4.37* 155.82±4.25* 132.75±1.40* 129.45±2.28*

3 討論

自體神經(jīng)移植是治療神經(jīng)缺損的有效方法,保證神經(jīng)功能有效修復(fù)的關(guān)鍵之一就在于受損神經(jīng)元是否成活、數(shù)量及其功能狀態(tài)[2]。BDNF是廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有明顯促進周圍神經(jīng)再生的作用,并有保護受損神經(jīng)細胞存活、防止神經(jīng)元死亡的作用[3]。當(dāng)坐骨神經(jīng)損傷后,由于軸索和髓鞘損傷,以至經(jīng)逆行軸漿運輸至胞體的BDNF及其他營養(yǎng)物質(zhì)明顯減少,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的運動神經(jīng)元胞體功能狀態(tài)也隨之發(fā)生相應(yīng)的改變。本實驗建立了大鼠自體的長段神經(jīng)移植模型,通過免疫組化的方法檢測BDNF在相應(yīng)脊髓節(jié)段前角運動神經(jīng)元內(nèi)表達及時相變化規(guī)律,驗證了移植術(shù)后BDNF在神經(jīng)元胞體內(nèi)表達增強,神經(jīng)元的功能狀態(tài)得到提高。提示內(nèi)源性BDNF持續(xù)表達對損傷的神經(jīng)元有保護營養(yǎng)作用,對軸突再生修復(fù)有促進作用。

在本研究的對照組中,BDNF在胞體內(nèi)有少量表達,表明BDNF對維持正常神經(jīng)元生理功能有一定的作用。在實驗組中,BDNF表達變化具有時間依賴性。神經(jīng)移植術(shù)后1周,相應(yīng)脊髓節(jié)段運動神經(jīng)元內(nèi)的表達就開始升高,提示在神經(jīng)損傷的早期BDNF就開始發(fā)揮作用。術(shù)后2周時,BDNF表達達到峰值,說明該時間點為神經(jīng)軸突生長的活躍期。之后BDNF表達持續(xù)在較高水平,6-8周后逐漸降低,但至8周時表達仍高于正常對照組,表明BDNF可持續(xù)作用于神經(jīng)元,防止神經(jīng)元的凋亡,以保證神經(jīng)處于良好的再生狀態(tài)中,但神經(jīng)的再生效率卻逐漸減低。有相關(guān)研究證實1cm的大鼠坐骨神經(jīng)移植術(shù)在術(shù)后4周才出現(xiàn)BDNF的表達高峰[4],而本研究在兩周后就出現(xiàn)高峰期,是否意味著長段移植可更早地激發(fā)神經(jīng)元胞體的功能狀態(tài)還有待進一步研究。

周圍神經(jīng)損傷的實質(zhì)是一種細胞損傷[5],因此必然累及到相應(yīng)的神經(jīng)元胞體,而胞體的功能狀態(tài)也必然影響神經(jīng)的再生與修復(fù),二者是相輔相成的。本研究僅通過BDNF的表達來揭示長段神經(jīng)移植術(shù)后脊髓運動神經(jīng)元功能狀態(tài),但同時也證實BDNF對損傷的神經(jīng)元有保護作用,并可促進神經(jīng)元損傷后的修復(fù)。因此如能在神經(jīng)損傷后能夠早期、持續(xù)、有效地維持神經(jīng)元的功能狀態(tài),將對神經(jīng)損傷修復(fù)具有重要意義。

[1]Sharma HS.Neuroprotective effects of neurotophins and melanocortins in spinal cord injury:An experimental study in the rat using pharmacological and morphological approaches[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1053:407.

[2]傅 陽,陳 亮,顧玉東.周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元保護的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué),2003,24(5):266.

[3]Marcolw,Kotulska K,Larysz-Bryszm,et al.Extracts obtained from predegenerated nerves improve functional recovery after sciatic nerve transection[J].Microsurgery,2005,25(6):486.

[4]張立新,賈 樺,李薇薇等.BDNF在脫細胞同種異體神經(jīng)移植物修復(fù)神經(jīng)缺損后不同組織中的表達[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,37(3):325.

[5]Natsume A,Mata M,Wolfe D,et al.Bcl-2 and GDNF delivered by HSV-mediated gene transfer after spinal root avuision provide a synergistic effect[J].Neurotrauma,2002,19(1):61.