風(fēng)心病慢性房顫患者左右心房組織纖維化程度及TGF-β1的mRNA表達差異的研究

劉玉學(xué),王 欣,王立清,王 巍,柳 磊,李 源,元 東,劉立群

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科,山東濰坊,261031;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院心血管病研究所阜外心血管病醫(yī)院心外科,北京,100037)

研究證實,心房間質(zhì)纖維化在房顫的發(fā)生和維持中起著重要的作用[1-3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是啟動與促進心房間質(zhì)膠原合成代謝的關(guān)鍵細胞因子,在心房纖維化過程中起到重要的調(diào)控作用[4-6]。但這些研究的取材大都來源于單側(cè)心房,左、右心房的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能不同,房顫時左右心房激動發(fā)生模式和維持方式也不同[7]。研究左右心房在參與房顫過程中的差別有助于進一步揭示房顫的本質(zhì)。本研究擬通過觀察風(fēng)濕性心臟病慢性房顫患者左右心房肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量及 TGF-β1的mRNA表達水平,探討風(fēng)心病慢性房顫患者左、右心房組織纖維化程度及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的 mRNA表達是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年1月～2008年9月在阜外心血管病醫(yī)院接受瓣膜置換+房顫外科射頻消融治療的風(fēng)濕性心臟病伴慢性房顫患者40例,同時期行瓣膜手術(shù)的風(fēng)濕性心臟病竇性心律患者10例作為對照組。詳細收集入選患者的術(shù)前臨床資料,包括一般資料、心電圖、超聲心動圖檢查等。入選病例均除外合并病態(tài)竇房結(jié)綜合癥、左房血栓、高血壓病、甲狀腺功能亢進癥、慢性肺源性心臟病、冠心病、心肌病、腎臟疾病和二次接受心臟手術(shù)者。所有入選病例均在術(shù)前經(jīng)患者和家屬同意,并簽訂知情同意書。

1.2 標本采集與保存

體外循環(huán)開始前收取左、右心耳標本各約100 mg(約1 cm×1 cm×2 cm)以生理鹽水沖洗并除去脂肪后分為2塊,1塊迅速置入液氮凍存用于檢測mRNA;一塊立刻置4%甲醛溶液中固定,4℃保存,標本脫水后,用石蠟包埋,制備切片待用苦味酸天狼猩紅染色做膠原容量分析。

1.3 TGF-β1的mRNA 表達水平測定

用RT-PCR法檢測,參照 RT-PCR試劑盒(TAKARA公司)操作說明進行。采用Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提心房組織總RNA,用紫外分光光度計(BECKMANDU640)測得各 RNA樣本260 nm/280 nm光密度的比值為1.8～2.0。取1μ g總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。檢索基因庫,查找目標基因和內(nèi)參β-actin cDNA序列,設(shè)計并合成引物。引物設(shè)計:

引物由北京奧科生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。每個標本各取1 μ L cDNA進行目標基因和內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:1 μ L cDNA,0.5 μ L Taq 酶 ,10 mmol/L dNTP 1 μ L,10 ×PCR 緩沖液2.5 μ L,10 pmol/L上 、下游引物各1 μ L,加入去離子水至總體積25 μ L。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,隨后進入PCR循環(huán),95℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán)后72℃延伸10 min。陰性對照:反應(yīng)體系中未加入模板總 RNA,代之以去離子水,其他如反應(yīng)體系、反應(yīng)條件等無改變。相同反應(yīng)體系中β-actin和目標基因各取PCR產(chǎn)物3 μ L,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,應(yīng)用Image Master VDSCL對凝膠成像,計算PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度積分,并以β-actin的灰度積分進行標準校正。目標基因PCR產(chǎn)物的相對量=目標基因電泳條帶灰度積分/β-actin電泳條帶的灰度積分。

1.4 膠原容量分析

常規(guī)石蠟包埋切片(厚度為0.5 μ m),二甲苯脫蠟入水,0.1%苦味酸天狼猩紅染色70 min,流水沖洗4 min,蒸餾水沖洗1 min,各級濃度乙醇脫水,二甲苯透明、中性樹膠封片;染色后的心房組織切片置于olympusBH2偏振光顯微鏡下觀察。將偏光顯微鏡調(diào)節(jié)到正交偏光觀察狀態(tài),可以看到I型膠原纖維呈紅色或明黃色,Ⅲ型膠原纖維呈綠色。每張切片避開血管區(qū)域隨機選取4個視野,在40×物鏡、1×拍攝鏡下采用JVC1481顯微鏡用攝像機對視野中圖像進行采集。用Image Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)對心房肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原組成含量進行半定量分析(膠原容量分數(shù)=膠原纖維面積/視野總面積)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理,所有計量數(shù)據(jù)用±s表示,兩組之間比較使用 t檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計用秩和檢驗,計數(shù)資料用χ2檢驗;變量間相互關(guān)系采用直線相關(guān)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床特征見表1

房顫組左心房內(nèi)徑較竇律組明顯增加(P<0.05)。兩組間其他臨床資料如年齡、左室射血分數(shù)、左室舒張末期內(nèi)徑、心功能NYHA分級、房顫病史時間等均無明顯差異。

表1 2組患者一般臨床特征比較

CVF-Ⅰ 、CVF-Ⅲ及CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ比值,見表2。與竇律組相比,房顫組患者左、右心房組織CVF-I及CVF-I/CVF-III比值均顯著增加(P<0.05);房顫組患者中左心房較右心房組織中CVF-Ⅰ及CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ比值明顯增加而(P<0.05);竇律組患者左心房與右心房CVF-Ⅰ及CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ無明顯區(qū)別(P>0.05);CVF-Ⅲ在竇律組和房顫組之間,兩組的左右心房之間均無明顯變化(P>0.05)。

2.2 TGF-β1的mRNA 表達,見表2

與竇律組相比,房顫組患者左、右心房組織的TGF-β1的 mRNA均顯著增加(P<0.05);房顫組患者中左心房較右心房組織中TGF-β1的mRNA比值明顯增加(P<0.05);竇律組患者左心房與右心房TGF-β1的mRNA無明顯區(qū)別。

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)無論左心房還是右心房,TGF-β1的mRNA表達水平與心房組織CVF-I表達呈正相關(guān)(左:r=0.786,P<0.05;右:r=0.858,P<0.05)。

3 討 論

心房間質(zhì)纖維化為房顫的發(fā)生提供了病理基質(zhì),即使是臨床上診斷為孤立性房顫的患者的活檢標本中也觀察到心房纖維化的存在,并且心房顫動的發(fā)生隨著纖維化程度的增加而增加[8-9]。心房間質(zhì)成分約85%由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成,Ⅰ型膠原合成增多被認為是間質(zhì)纖維化的主要因素,本研究結(jié)果顯示,與竇律組比較房顫組患者左、右心房肌組織中的CVF-I、CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ均明顯增加,CVF-Ⅲ無明顯變化。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果類似,表明心房間質(zhì)纖維化主要表現(xiàn)為I型膠原的合成增多,造成心房肌細胞外基質(zhì)總膠原含量的增加,各型膠原比例發(fā)生變化,導(dǎo)致心房間質(zhì)纖維化,從而促使房顫的發(fā)生和維持[3,10-11]。

表2 兩組心房組織膠原容量分數(shù)及TGF-β1的mRNA表達結(jié)果比較

目前針對心房纖維化的研究結(jié)果大多來源于對單側(cè)心房肌的研究,關(guān)于左、右心房對比的研究較少。本研究經(jīng)過對左、右心房的對比分析后發(fā)現(xiàn),風(fēng)心病竇性心律患者左右心房中CVF-Ⅰ、CVF-Ⅲ、CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;在風(fēng)心病慢性房顫患者,左房中的CVF-Ⅰ、CVF-Ⅰ/CVF-Ⅲ明顯高于右心房,CVF-Ⅲ無明顯變化。這個結(jié)果表明在風(fēng)心病慢性房顫的過程中,心房纖維化的程度存在心腔差異,左心房的纖維化更加明顯。目前已有研究表明[7,12],房顫過程中左右心房的顫動頻率不一致,存在著頻率梯度,這是因為房顫的起源部位不一致和激動模式不一致造成的。房顫過程中,左心房為電激動主動心房,右心房為被動心房,左心房可檢測到快速反復(fù)的激動波,而右心房則為紊亂的顫動波和傳導(dǎo)阻滯區(qū)。左右心房纖維化程度的差異可能正是在風(fēng)心病慢性房顫過程中左、右心房不同生理狀態(tài)一種作用結(jié)果。

TGF-β1作為最重要的促纖維性細胞因子之一,在心房肌間質(zhì)纖維化及房顫發(fā)生、維持中起到重要調(diào)控作用。TGF-β1的mRNA增加能提高心房組織局部 TGF-β1表達增加,從而增加心肌成纖維細胞I型膠原在這些細胞中的合成,促進心房肌細胞間質(zhì)纖維化的進展[13]。本研究結(jié)果顯示無論左右心房組織TGF-β1的mRNA表達在房顫組均比竇性心律組明顯增加,竇律患者中左右心房之間TGF-β1的mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)意義,在房顫患者中左心房TGF-β1的mRNA表達較右心房明顯增加,與CVF-I在各心腔的變化結(jié)果一致。另外相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)無論在左右心房均TGF-β1的mRNA表達水平與CVF-I呈明顯正相關(guān),這兩點很好地說明TGF-β1是心房纖維化的重要分子機制,在心房纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,在風(fēng)心病慢性房顫的過程中,左、右心房間質(zhì)纖維化均是以TGF-β1的mRNA轉(zhuǎn)錄為分子基礎(chǔ),作為電生理激動的主要部位,左心房組織纖維化程度及TGF-β1的mRNA表達較右心房更加明顯。

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