水楊酸衍生物的合成及生物活性測定

齊 兵， 馮 磊， 陳 達， 吳引超， 巨修練

(湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學工藝重點實驗室； 武漢工程大學化工與制藥學院， 湖北 武漢 430074)

0 引言

水楊酸是植物體中一種重要的內(nèi)源信號分子，其能夠激活一系列抗逆性防衛(wèi)反應(yīng)，并且在植物體內(nèi)普遍存在，具有一些重要的生理作用.例如：促進植物開花、提高植物抗性、減少植物水分散失、抑制乙烯合成等.

水楊酸也是重要的精細有機合成中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、合成香料、植物保護等領(lǐng)域.最早的水楊酸用于合成醫(yī)藥阿司匹林(ASA)，后來用于合成香料冬青油.在水楊酸分子中引入酰胺基[1-4]之后，由于酰胺化反應(yīng)是在分子中引入酰胺基的反應(yīng)過程，可用于許多具有重要藥用價值的肽類激素、神經(jīng)肽、毒素等的碳端酰胺化修飾，既保持了有機高分子的特性，又具有酰胺基的特性，所以對酰胺化材料的設(shè)計、合成、結(jié)構(gòu)和性能研究成為近年來十分活躍的領(lǐng)域，而且它跨越了有機化學特別是高分子化學、生物學、材料學、醫(yī)藥學等學科領(lǐng)域，所以該類水楊酸衍生物具有廣泛的生物活性，尤其在農(nóng)藥領(lǐng)域已經(jīng)成為一個新的研究熱點，比如上世紀70年代后用于合成農(nóng)藥水胺硫磷、甲基異柳磷等殺蟲劑品種，并用于合成染料等[5].

因此，水楊酸衍生物的研究具有重要的學術(shù)價值和藥學意義.為尋找新型的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，以新方法合成了6個已見文獻的水楊酸衍生物，并且6個化合物都引入了具有廣泛生物活性的酰胺基.文獻[6-7]中的方法均是先將水楊酸(鄰羥基苯甲酸)?；舌徚u基苯甲酰氯，然后再與芳胺縮合得到目標化合物，單步產(chǎn)率都在80%以上，總產(chǎn)率為50%左右.而本研究則是以DMAP(4-N,N-二甲基吡啶)和EDCI(1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺)為催化劑，直接將水楊酸與芳胺縮合得到目標化合物.

文中所有目標化合物結(jié)構(gòu)均由熔點、1H NMR、MS表征確證.大量國內(nèi)外文獻[8-11]報道了這6個水楊酸衍生物抗菌方面的活性，如對type I MetAP， Type III Secretion in Yersinia病菌等都有非常高的活性.然而卻沒有文獻報道這6個化合物對草坪褐斑病菌[12]和水稻紋枯病菌[13]的抑菌效果.本實驗采用平皿生長速率法測定了6個化合物對草坪褐斑病菌和水稻紋枯病菌的抑制效果，所有化合物均表現(xiàn)出一定的抑菌活性.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

RY-1型熔點儀；BRUKER Avance400核磁共振儀; LGQ AB Thermo Finigan質(zhì)譜儀.

實驗中所用試劑均為分析純或化學純，柱層析硅膠為孔徑為4 nm，青島海洋化工；阿司匹林參照文獻[14]方法制備；6個含氨基的芳環(huán)和雜環(huán)原料由實驗室購買；草坪褐斑病菌和水稻紋枯病菌由武漢工程大學化工與制藥學院韓新才教授提供.

1.2 目標化合物的合成

1.2.1 目標化合物2a,2b,2c的合成 以水楊酸為起始原料，經(jīng)過乙酰化得到阿斯匹林(ASA)，再與芳胺縮合反應(yīng)，得到化合物2a, 2b, 2c.合成路線如圖1所示.

圖1 化合物2a-2c的合成路線

ASA的合成：在250 mL的錐形瓶中，加入水楊酸2.0 g，醋酐5.0 mL；然后用滴管加入5滴濃硫酸，緩緩地旋搖錐形瓶，使水楊酸溶解.將錐形瓶放在水浴上慢慢加熱至85～90 ℃，維持溫度10 min.然后將錐形瓶從熱源上取下，使其慢慢冷卻至室溫.在冷卻過程中，阿司匹林漸漸從溶液中析出.在冷到室溫，結(jié)晶形成后，加入水50 mL；并將該溶液放入冰浴中冷卻.待充分冷卻后，大量固體析出，抽濾得到固體，冰水洗滌，并盡量壓緊抽干，得到阿司匹林粗品.空氣中風干，稱重，粗產(chǎn)物約1.8 g.將阿司匹林粗品放在150 mL燒杯中，加入飽和的碳酸氫鈉水溶液25 mL.攪拌到?jīng)]有二氧化碳放出為止(無氣泡放出，嘶嘶聲停止).有不溶的固體存在，真空抽濾，除去不溶物并用少量水(5～10 mL)洗滌.另取150 mL燒杯一只，放入濃鹽酸4～5 mL和水10 mL，將得到的濾液慢慢地分多次倒入燒杯中，邊倒邊攪拌.阿司匹林從溶液中析出.將燒杯放入冰浴中冷卻，抽濾固體.并用冷水洗滌，抽緊壓干固體，轉(zhuǎn)入表面皿上，干燥約1.5 g.收率為58%, mp: 133～135 ℃.

攪拌下, 依次加入二氯甲烷20 mL，阿司匹林0.9 g(0.5 mol)，苯胺0.47 g(0.5 mol)和DMAP 0.73 g(0.5 mol)，室溫反應(yīng)30 min后，加入1.15 g (0.5 mol) EDCI，TLC追蹤反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，趁熱過濾，濾液減壓至干，殘余物加入50 mL氯仿溶解，15 mL×2水洗滌氯仿層，氯仿層用無水硫酸鈉干燥，抽濾之后蒸除溶劑，柱層析純化得到0.55 g白色固體，產(chǎn)率為43%.即得目標化合物2a.同方法可得目標化合物2b和2c.

2-(苯氨基甲?；?乙酸苯酯(2a): 白色固體0.55 g, 產(chǎn)率: 43%, mp: 138～139 ℃,1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 2.46 (s, 3H, CH3), 7.1～7.3 (m, 5H, ArH), 7.6 (m, 3H, ArH), 8.1 (d, 1H, ArH), 7.9 (s, 1H, NH); MS (ESI): 256 (M+1).

2-(噻唑-2-氨基甲?；?乙酸苯酯(2b): 白色固體0.61 g, 產(chǎn)率: 46%, mp: 140～142 ℃,1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 2.46 (s, 3H, CH3), 6. 52 (d, 1H, ArH), 6. 93 (d, 1H, ArH), 7.14 (d, 2H, ArH), 7.42 (d, 2H, ArH), 7.88 (s, 1H, NH); MS (ESI): 263 (M+1).

2-(4-甲基噻唑-2-氨基甲?；?乙酸苯酯(2c): 淺黃色固體0.48 g, 產(chǎn)率: 35%, mp: 153～155 ℃,1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.7 (s, 3H, CH3), 2.45 (s, 3H, CH3), 6.7 (s, 1H, ArH), 7.18 (d, 2H, ArH), 7.44 (d, 2H, ArH), 7.82 (s, 1H, NH); MS (ESI): 277 (M+1).

1.2.2 目標化合物3a,3b,3c的合成 以水楊酸為起始原料，與芳胺縮合反應(yīng)，得到化合物3a, 3b, 3c.合成路線如圖2所示.

圖2 化合物3a-3c的合成路線

攪拌下, 依次加入二氯甲烷20 mL, 水楊酸0.69 g(0.5 mol)，鄰氯苯胺0.64 g(0.5 mol)和DMAP 0.73 g(0.5 mol)，室溫反應(yīng)30 min后，加入1.15 g (0.5 mol) EDCI，TLC追蹤反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，趁熱過濾，濾液減壓至干，殘余物加入50 mL氯仿溶解，15 mL×2水洗滌氯仿層，氯仿層用無水硫酸鈉干燥，抽濾之后蒸除溶劑，柱層析純化得到0.47 g白色固體，產(chǎn)率為38%.即得目標化合物3a.同方法可得目標化合物3b和3c.

N-(2-氯苯基)-2-羥基苯甲酰胺(3a): 白色固體0.47 g, 產(chǎn)率: 38%, mp: 166～168 ℃,1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 6.9～7.1 (m, 2H, ArH), 7.16 (m, 1H, ArH), 7.4～7.55 (m, 3H, ArH), 8.1 (m, 1H, ArH), 8.4 (m, 1H, ArH), 10.9 (s, 1H, OH), 11.9 (s, 1H, NH); MS (ESI): 246 (M-1).

N-(3-氯苯基)-2-羥基苯甲酰胺(3b): 白色固體0.49 g, 產(chǎn)率: 40%, mp: 172～173 ℃,1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 6.9～7.0 (m, 2H, ArH), 7.2 (m, 1H, ArH), 7.37～7.6 (m, 2H, ArH), 7.7 (m, 1H, ArH), 7.9 (m, 2H, ArH), 8.4 (m, 1H, ArH), 10.47 (s, 1H, OH), 11.54 (s, 1H, NH); MS (ESI): 246 (M-1).

N-(4-氯苯基)-2-羥基苯甲酰胺(3c): 白色固體0.53 g, 產(chǎn)率: 43%, mp: 170～171 ℃,1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 6.9～7.0 (m, 2H, ArH), 7.37～7.5 (m, 3H, ArH), 7.8 (m, 2H, ArH), 7.95 (m, 1H, ArH), 10.45 (s, 1H, OH), 11.63 (s, 1H, NH); MS (ESI): 246 (M-1).

1.3 抑菌活性研究

采用平皿生長速率法測定6個化合物對草坪褐斑病菌和對水稻紋枯病菌病的抑制效果.

1.3.1 樣品配制 將6個待測化合物分別用DMSO配制成濃度為10 000 μg·mL-1的溶液，各10 mL.

1.3.2 測定方法 在無菌操作臺上用移液槍吸取1 mL配制好的(以DMSO為對照)加到直徑為7.5 cm的培養(yǎng)皿中，然后用無菌玻璃注射器注入9 mL融化后約60 ℃的PDA培養(yǎng)基，使藥液與培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中混勻，室溫冷卻，再在培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基正中間位置接種5 mm的草坪褐斑病菌塊(水稻紋枯病菌同法)，每個處理3個重復(fù).接種后的培養(yǎng)皿倒放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～40 h，待對照接近長滿培養(yǎng)皿，用尺測量菌落直徑，每個培養(yǎng)皿重復(fù)十字交叉測量3次，取其平均值，最后計算藥劑的菌絲抑菌率.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在目標化合物的合成中，文獻中的方法均是先將水楊酸(鄰羥基苯甲酸)?；舌徚u基苯甲酰氯，然后再與芳胺縮合得到目標化合物，單步產(chǎn)率都在80%以上，總產(chǎn)率為50%左右.該方法操作復(fù)雜(尤其后處理的減壓蒸餾)，反應(yīng)條件要求較高，中間體酰氯難以保存、難以提純，且對人的身體和自然環(huán)境都有很大危害.而本實驗則是以DMAP和EDCI為催化劑，直接將水楊酸與芳胺縮合得到目標化合物，省去制備酰氯這一步.此法不僅能縮短反應(yīng)步驟，簡化操作過程，節(jié)省許多試劑和原料，而且反應(yīng)條件溫和，后處理簡單，對人的身體和自然環(huán)境都比較友好，并與文獻方法得到的總產(chǎn)率50%幾乎一致.

2.2 抑菌活性

對6個目標化合物進行抑制草坪褐斑病菌和水稻紋枯病菌的活性測試.結(jié)果如表1所示.

表1 目標化合物對草坪褐斑病菌和對水稻紋枯病菌的抑菌率

初步測試結(jié)果表明：6個目標化合物對兩種病菌都有一定的抑制效果.10 000 μg·mL-1濃度下化合物3a, 3b, 3c對草坪褐斑病菌具有較高的抑制活性，分別達到25.56%，22.51%，21.05%，約為2a, 2b, 2c的2～3倍.而化合物3a，3b，3c在10 000 μg·mL-1濃度下對水稻紋枯病菌也具有較高的抑制活性，分別達到44.26%, 34.44%, 31.43%, 與2a, 2b, 2c的抑制活性相比約為3～4倍.因此，從結(jié)構(gòu)-活性的關(guān)系判斷：水楊酸的衍生物要比乙酰水楊酸的衍生物抑菌活性高，含氯芳環(huán)的衍生物要比含雜環(huán)的衍生物抑菌活性高.而所有目標化合物對水稻紋枯病菌的抑菌活性相對草坪褐斑病菌的略高.

3 結(jié) 語

以水楊酸為起始原料，以新方法合成了6個已見文獻的水楊酸衍生物，6個目標化合物都引入了具有廣泛生物活性的酰胺基.與文獻中的合成方法相比，此法不僅縮短了反應(yīng)步驟，簡化了操作過程，節(jié)省了許多試劑和原料，而且反應(yīng)條件溫和，后處理簡單，并對人的身體和自然環(huán)境都比較友好.目標化合物均由熔點確證，1H NMR、MS表征.并對其進行抑制草坪褐斑病菌和水稻紋枯病菌的活性測試，其中目標化合物3a，3b，3c對兩種病菌都表現(xiàn)出了較好的抑制效果，其機理有待于進一步研究.

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