FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鑒定中的應(yīng)用

魯巧云 余進(jìn) 劉偉 楊建勛 馬蕾 李若瑜

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京100034;2.中日友好醫(yī)院皮膚科，北京100029)

隨著免疫缺陷宿主的不斷增多，臨床上真菌感染率不斷上升，提高真菌病診斷、鑒定水平刻不容緩。無論是診斷還是鑒定，均離不開分子生物學(xué)方法的輔助，而獲得優(yōu)質(zhì)的基因組DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。真菌由于存在細(xì)胞壁，DNA提取相對困難。目前常用的真菌DNA提取方法有多種，主要在于破壁方式的不同，包括蛋白酶K消化法、酚氯仿抽提法、玻璃珠研磨法、冷凍干燥法等，耗時長，需要的設(shè)備和試劑多，步驟繁瑣。我們介紹一種快速簡易的FTA-DNA卡片式直接提取法。該方法目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、植物、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的基因組DNA提?。?］，在真菌領(lǐng)域的研究才剛剛開始。

1 材料和方法

1.1 菌株及臨床標(biāo)本來源

菌株選取本實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)株和部分臨床分離株，包括近平滑念珠菌 (ATCC00273)、白念珠菌 (ATCC00270)、光滑念珠菌(ATCC00271)、季也蒙念珠菌 (ATCC00278)、克柔念珠菌 (ATCC002 79)、乳酒念珠菌(ATCC00272)、熱帶念珠菌 (ATCC03097)、煙曲霉 (AF293)、土曲霉 (BMU04682)、黃曲霉(BMU04683)、黑曲霉 (BMU03920)、新生隱球菌 (BMU01121)、小 孢 根 霉 (BMU04685、BMU28669、BMU02535)、米根霉 (BMU04481、BMU01335、BMU02702)、 卷 曲 毛 霉(BMU02467、BMU00959)、多 變 根 毛 霉(BMU02259、BMU02257、BMU02707)、傘枝犁頭霉 (BMU04669)、紫色毛癬菌 (BMU03340、BMU03341、 BMU03342、 BMU03343、BMU03354)、紅 色 毛 癬 菌 (BMU28619、BMU28662、 BMU28638、 BMU28616、BMU28629)、斷發(fā)毛癬菌 (BMU04726)、疣狀瓶霉 (BMU00107)、歐洲瓶霉 (BMU04715)、裴氏著色霉 (BMU04771)、茄病鐮刀菌(BMU04332)、尖 端 賽 多 孢 (BMU00488、BMU01112、 BMU01113、 BMU01114、BMU01118、BMU04772)。所選臨床標(biāo)本為臨床確診真菌感染患者的口腔拭子 (2例)、宮頸拭子 (2例)與腹水 (1例)、胸水 (1例)。所有念珠菌臨床分離株均經(jīng)CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基和API 20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定，其他臨床分離株由本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合形態(tài)學(xué)和基因序列分析方法鑒定。

1.2 DNA提取主要試劑及設(shè)備

Whatman FTA卡 (貨號:WB120205)，Harris Uni-core取樣器 (2 mm)及墊板 (貨號:WB100029)，滅菌蒸餾水，干燥儀。

1.3 DNA 提取過程

菌懸液的FTA卡片制備 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～14 d待生長旺盛后，用接種針蘸取少許孢子或菌絲，加入100μL滅菌蒸餾水中，用槍頭反復(fù)吹打使其分散，配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙骸⒕鷳乙旱卧贔TA卡片指示圈中央，等待2 h自然晾干。

臨床標(biāo)本的FTA卡片制備 腹水、胸水來源的臨床標(biāo)本直接取100μL滴于卡片中央，口腔及宮頸拭子用1 mL滅菌蒸餾水沖洗后離心，將沉淀重懸于50μL滅菌蒸餾水并滴于卡片上，等待2 h自然晾干。

FTA卡片的洗滌 FTA卡片的洗滌采用匡金枝等改進(jìn)的方法［2］。用 Harris Uni-core取樣器在FTA卡片的樣本彌散圈內(nèi)任意位置取下一直徑2 mm的圓片置于0.5 mL Eppendorf管中，加入200 μL滅菌蒸餾水洗滌并浸泡5 min，重復(fù)洗滌1～2次后，將裝有圓片的Eppendorf管置于干燥儀上，于100℃干燥5～10 min，備用。

1.4 降落 PCR(Touchdown PCR)

擴(kuò)增片段選擇ITS1區(qū)，上游引物ITS1:TTCGTAGGTGAACCTGCGG，下游引物 ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC。反應(yīng)體系25μL，每個反應(yīng)管分裝 ddH2O 15μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTP 100μM，上下游引物各400 nM，Taq聚合酶2 U，將干燥的卡片加入此反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，68～58℃之間退火30 s(每個循環(huán)降1℃)，72℃延伸40 s，10個循環(huán)，再在58℃退火 30 s，30 個循環(huán)，后延伸 10 min［3］。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余PCR產(chǎn)物送測序。

1.5 質(zhì)量控制

取2個不同樣品之間的空白處打孔作為陰性對照，陰性對照無擴(kuò)增。

1.6 檢測限評價

將煙曲霉基因組測序株AF293接種于YAG培養(yǎng)基，2～3 d生長旺盛后用0.03%吐溫鹽水沖洗孢子，配制成0.3麥?zhǔn)蠞岫鹊逆咦討乙?，孢子?jì)數(shù)至106個cell/mL，倍比稀釋成105個cell/mL、104個 cell/mL、103個 cell/mL、102個 cell/mL。五個濃度菌懸液各取100μL滴于FTA卡指示圈中央，自然晾干后于卡片中央取下一2 mm圓片用于PCR擴(kuò)增。

1.7 孢子滅活試驗(yàn)

為了評價卡片對病原真菌的滅活能力，我們對不同濃度菌懸液制備的卡片進(jìn)行了真菌培養(yǎng)。參照1.6所示的具體步驟配制1.0×106個 cell/mL、1.0 ×105個 cell/mL、1.0 ×104個 cell/mL、1.0 ×103個cell/mL 4個濃度的孢子懸液，各取100μL分別滴于4個FTA卡指示圈中央，自然晾干后在4個卡片彌散圈中央和邊緣各取下一2 mm圓片，接種于YAG平皿，35℃培養(yǎng)48 h。本試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)2次。

2 結(jié) 果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

所有菌株提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后均能得到1條清晰的擴(kuò)增片段。6種念珠菌菌株提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 測序結(jié)果

所有PCR產(chǎn)物均正常測序，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對，符合率在98% ～100%之間。

2.3 檢測限評價

1.0 ×106個 cell/mL、1.0 ×105個 cell/mL、1.0×104個cell/mL、1.0 ×103個cell/mL 4 個濃度的孢子懸液均有擴(kuò)增。1.0×102個cell/mL濃度的孢子懸液無擴(kuò)增(見圖2)。該DNA提取方法聯(lián)合降落PCR能檢測到103個cell/mL的孢子懸液。

2.4 孢子滅活試驗(yàn)

106個cell/mL和105個cell/mL兩個濃度的孢子懸液制備的FTA卡在彌散圈中央打孔取片后經(jīng)培養(yǎng)有真菌生長，且菌落直徑隨著孢子懸液濃度的降低而減小，104個 cell/mL和103個 cell/mL兩個低濃度孢子懸液未見有真菌生長。所有濃度孢子懸液的彌散圈邊緣打孔取片后均未培養(yǎng)出真菌(見圖3)。由此可見孢子懸液在FTA卡片上的分布不均勻，中央濃度高于邊緣。1.0×104個 cell/mL及以下濃度的孢子懸液可以被FTA卡完全滅活。

2.5 臨床標(biāo)本的病原菌鑒定

應(yīng)用Whatman FTA卡從6份臨床標(biāo)本包括口腔拭子 (2例)、宮頸拭子 (2例)與腹水 (1例)、胸水(1例)中提取DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序，并進(jìn)行序列比對。測序鑒定結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果完全一致，口腔拭子和宮頸拭子的致病真菌均為白念珠菌，腹水、胸水中致病真菌為克柔念珠菌。6例臨床標(biāo)本擴(kuò)增的電泳結(jié)果見圖4。

圖1 不同種念珠菌的ITS1擴(kuò)增的電泳情況:第1泳道為marker，2～7依次為近平滑念珠菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌，8為陰性對照 圖2 不同濃度的孢子懸液ITS1區(qū)擴(kuò)增的電泳情況:第1泳道為marker，2～6依次為106個cell/mL、105個cell/mL、104個cell/mL、103個cell/mL、102個cell/mL 圖3 將不同濃度煙曲霉孢子懸液接種于FTA卡片上，在卡片彌散圈中央和邊緣各取下一圓片置于YAG平皿培養(yǎng)48 h后的結(jié)果 圖4 6例臨床標(biāo)本ITS1區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖:第1泳道為marker，2、3為口腔拭子，4、5為宮頸拭子，6為腹水，7為胸水Fig.1 PCR amplification of ITS1 of Candida spp.:Lane 1.DNA marker，lane 2.Candida parapsilosis，lane 3.Candida albicans，lane 4.Candida glabrata ，lane 5.Candida krusei，lane 6.Candida guilliermondii，lane 7.Candida Kefyr，lane 8.negative control Fig.2 PCR amplification of ITS1 from serial diluted suspension of conidia:lane 1.DNA marker，lane 2.106 cell/mL，lane 3.105 cell/mL，lane 4.104 cell/mL，lane 5.103 cell/mL，lane 6，102 cell/mL Fig.3 Conidia of suspension of A.fumigatus was prepared and inoculated directly onto FTA cards.Filter punches from both the center and the edge were removed and cultivated on YAG plates for 48 hours Fig.4 PCR amplification of ITS1 from 6 clinical specimens:lane 1.DNA marker，lane 2，3.oral swabs，lane 4，5.cervical swabs，lane 6.ascitic fluid，lane 7.pleural fluid

3 討 論

FTA卡通過特殊的化學(xué)處理使細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞器裂解，蛋白變性，物理性捕獲核酸于卡片上，同時能滅活細(xì)菌、病毒，抑制真菌的生長。適用于多種樣品的DNA提取，包括血液、組織、細(xì)胞、植物等。而且DNA能在卡片上常溫保存十幾年，為DNA的保存和攜帶提供了極大的方便［1］。目前法醫(yī)領(lǐng)域已成功將FTA卡應(yīng)用于自動化工作站，批量用于常規(guī)的基因分型研究［4］。

在真菌領(lǐng)域，目前關(guān)于FTA卡片的研究較少。Borman等［5］試驗(yàn)了包括38種酵母菌和75種絲狀真菌在內(nèi)的226株臨床分離株，其中218株能成功用于下游的PCR反應(yīng)，8株無法使用該方法提取DNA，原因未明，但他們認(rèn)為和產(chǎn)孢多少無關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)同一個卡片能反復(fù)多次用于PCR反應(yīng)，因?yàn)镈NA模板始終纏繞在卡片上，而原PCR體系中的其他成分通過洗滌不會進(jìn)入下一輪反應(yīng)體系。rDNA基因間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2區(qū)能區(qū)分很多酵母菌［6-7］和絲狀真菌［8］。Borman 等聯(lián)合 FTA卡和ITS1區(qū)測序能成功區(qū)分足菌腫的多種病原并應(yīng)用于種系發(fā)生分析。聯(lián)合FTA卡和ITS2區(qū)焦磷酸測序技術(shù)能在6 h內(nèi)從菌落中將大部分常見酵母菌鑒定至種水平［9］。FTA卡極大地縮短了DNA提取的時間，使得快速菌種鑒定成為可能。

本研究涉及的45種病原真菌采用FTA-DNA直接提取法均成功提取了基因組DNA并用于下游的PCR反應(yīng)，達(dá)到了快速測序鑒定菌種的目的，與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果完全一致。并從腹水、胸水、口腔拭子、宮頸拭子來源的臨床標(biāo)本直接提取DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)后均成功測序達(dá)到了菌種鑒定的目的，提示此方法可用于從上述臨床標(biāo)本中直接提取適用于分子鑒定目的的基因組DNA。

100μL孢子懸液滴于卡片上可形成1 cm左右直徑的彌散圈，平均用于每個PCR反應(yīng)的2 mm圓片所含菌量約為總菌量的1/25。但由于菌懸液在卡片上的不均勻分布，我們無法精確計(jì)算每個圓片平均所含的孢子數(shù)。本研究只是提及該DNA提取方法聯(lián)合降落PCR能檢測到1.0×103個cell/mL的孢子懸液。另一方面，該不均勻分布性恰好有利于少量DNA的聚攏濃縮。

孢子滅活試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)TA卡對真菌的滅活程度取決于菌量的多少，與Borman等的結(jié)果一致［5］。Borman、Suzuki等認(rèn)為使用微波預(yù)處理菌懸液能更有效地滅活真菌，但對于危害性較大的真菌仍然建議使用其他更安全的DNA提取方法［5，10］。

傳統(tǒng)的DNA提取方法通常需要4～6 h的換液、離心等操作，對操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和試劑、設(shè)備的要求較高，極大地制約了其臨床推廣的可能，也成了流行病學(xué)調(diào)查等大樣本基因操作的瓶頸。而FTA-DNA直接提取法不僅簡化了病原真菌DNA的提取，且成本低廉，同時能作為DNA常溫長期保存的載體，集菌種采集、DNA的提取和保存于一身，特別適宜快速菌種鑒定、野外采集標(biāo)本、流行病學(xué)調(diào)查、多態(tài)性分析、分類學(xué)研究等大樣本基因操作。

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