實驗性小鼠皮膚著色真菌病MCP-1和MIP-2研究

柴寶 熊瑛

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院皮膚科，深圳518052;2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院皮膚科，深圳518052)

著色真菌病發(fā)病機制的研究進展認為細胞免疫(CMI)在其防御機制中非常重要［1-3］。炎癥細胞在眾多因子的作用下聚集到炎癥部位，發(fā)揮免疫作用。趨化性細胞因子 (chemokine)作為參與炎癥過程的重要細胞因子，對白細胞有趨化和化學(xué)增活作用。盡管在真菌感染中趨化性細胞因子作用的研究有較多報道，但著色真菌病趨化性細胞因子方面的研究尚為空白。本文選取對多種免疫效應(yīng)細胞具有趨化作用的MCP-1(單核細胞趨化蛋白)、MIP-2(IL-8，中性粒細胞趨化因子)，在建立小鼠皮膚著色真菌病模型基礎(chǔ)上，實時定量PCR方法檢測感染后不同時間內(nèi)小鼠皮損局部組織中2種趨化性細胞因子的mRNA表達水平，ELISA方法檢測皮膚組織中2種趨化因子相應(yīng)的蛋白水平，探討趨化性細胞因子在著色真菌感染中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

卡氏支孢霉D10a，由中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心 (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京)提供。RNA抽提試劑盒購自QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Gibco公司產(chǎn)品，熒光實時定量PCR試劑盒為Invetrogen公司產(chǎn)品，小鼠MCP-1、MIP-2 ELISA試劑盒購自深圳晶美生物公司，地塞米松和甲氨蝶呤購自Sigma公司。

1.2 卡氏支孢霉懸液制備

將普通沙氏培養(yǎng)基(SDA)26℃培養(yǎng)2周的卡氏支孢霉黑色菌落挑出，制備濃度為1×108cfu/mL的卡氏支孢霉懸液，另外，再將部分卡氏支孢霉懸液高壓滅菌備用。

1.3 小鼠皮膚著色真菌病模型

選取6～8周齡雄性ICR小鼠，18～22 g，隨機分為3組，每組15只:A組為正常小鼠皮下接種1×108cfu/mL滅活卡氏支孢霉懸液0.025 mL;B組為正常小鼠皮下接種同樣濃度和體積的卡氏支孢霉懸液;C組為小鼠先經(jīng)腹腔注射甲氨蝶呤100 mg/kg(1次/3 d，共2次)，同時灌喂地塞米松2 mg/(kg·d)連續(xù)8 d以造成免疫抑制后，皮下接種同樣濃度和體積的卡氏支孢霉懸液。各組動物在接種后第7 d、30 d、60 d每次處死5只小鼠，取病變處皮膚組織，-70℃保存。

1.4 熒光實時定量PCR

采用TRIzol法提取總RNA，測定純度并定量后逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green Real Time PCR法檢測MCP-1、MIP-2 mRNA的表達。以人GAPDH做內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。根據(jù)標準曲線計算待測cDNA量。

1.5 ELISA

皮損組織勻漿后，按說明書方法依次加入樣品/標準品、生物素化抗體、酶結(jié)合物工作液、顯色劑，最后加入終止液后酶標儀450 nm測吸光度，根據(jù)標準曲線計算各樣本MCP-1、MIP-2濃度，并以各樣本蛋白濃度將結(jié)果標準化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)分析計算。所有數(shù)據(jù)均以珋x±s表示。兩組比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 卡氏支孢霉感染對MCP-1、MIP-2的影響

在接種卡氏支孢霉后7 d，接種活菌的B組皮損組織中MCP-1、MIP-2的mRNA含量明顯高于接種滅活菌的A組 (P ＜0.05，見圖1)。ELISA法檢測局部皮損組織中MCP-1、MIP-2也得到了類似結(jié)論 (P ＜0.05，見圖 2)。

2.2 皮膚著色真菌病小鼠皮損處MCP-1、MIP-2的動態(tài)表達

B組小鼠接種卡氏支孢霉后7 d、30 d、60 d動態(tài)檢測局部皮損組織中MCP-1、MIP-2的mRNA含量及蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 d時表達明顯高于30 d和60 d(P ＜0.05)，而30 d與60 d相比無明顯差別 (P ＞0.05，見圖1、2)。

2.3 免疫抑制對皮膚著色真菌病發(fā)病過程中MCP-1、MIP-2表達的影響

免疫抑制小鼠(C組)接種卡氏支孢霉后早期(7 d)，MCP-1、MIP-2表達水平明顯低于B組小鼠(P ＜0.01);但在卡氏支孢霉接種后期 (30 d、60 d)，兩者的表達與B組小鼠無明顯差異 (P＞0.05，見圖 1、2)。

2.4 基本病理改變

各組在7 d時以中性粒細胞浸潤、壞死、膿腫形成為主，B組較C組、A組明顯，各組30d、60d時以上皮樣肉芽腫反應(yīng)為主，B組較C組、A組輕，B組、C組可見硬殼細胞。部分病理圖片見圖3～5。

3 討 論

趨化性細胞因子在著色真菌感染中作用的研究罕見。白念珠菌感染過程中相關(guān)研究較多。Jiang［4］、Filler［5］、Schaller［6］等分別檢測單一核細胞、內(nèi)皮細胞和口腔上皮細胞在白念珠菌刺激下趨化性細胞因子的表達，證實念珠菌可使上述細胞產(chǎn)生趨化性細胞因子，提示趨化性細胞因子可能參與了宿主對念珠菌的防御反應(yīng)。

圖1 Real-time PCR的方法檢測皮損局部MCP-1、MIP-2 mRNA水平 圖2 ELISA法檢測皮損局部MCP-1、MIP-2蛋白水平 圖3 B組7 d時組織病理 (HE，×40) 圖4 C組30 d時組織病理 (HE，×40) 圖5 B組60d時組織病理:可見硬殼小體(HE×400)Fig.1 MCP-1 and MIP-2 mRNA examined by real-time PCR Fig.2 MCP-1 and MIP-2 protein level examined by ELISA Fig.3 Histology in Group B on day 7(HE，×40)Fig.4 Histology in Group Con day 30(HE，×40)Fig.5 Histology in Group B on day 60 Sclerotic body(HE，×400)

其他真菌亦有相關(guān)報道，Schelenz等［7］發(fā)現(xiàn)曲霉孢子可誘使宿主產(chǎn)生MCP-1、MIP-2。Goldman等［8］將人類小膠質(zhì)細胞暴露于新生隱球菌，發(fā)現(xiàn)其可表達MCP-1、MIP-2等因子。Souto等［9］證實小鼠肺巴西副球孢子菌感染后的急性炎癥早期，肺部有高水平MCP-1表達。Kudeken等［10］體外實驗證實MIP-2在內(nèi)的多種中性粒細胞激活因子均能增強中性粒細胞對馬尼非青霉出芽的抑制作用。上述研究證實隱球菌、曲霉、巴西副球孢子菌等真菌感染的防御機制中有MCP-1、MIP-2參與，但迄今為止趨化性細胞因子在著色真菌感染中的研究罕見。

本研究結(jié)果顯示各組小鼠在接種卡氏支孢霉后7 d、30 d、60 d時MCP-1、MIP-2 的mRNA 均呈陽性表達，同時ELISA檢測蛋白亦證實了 MCP-1、MIP-2的存在。7 d時免疫正常接種卡氏支孢霉活菌組MIP-2、MCP-1基因表達水平明顯高于免疫正常接種卡氏支孢霉滅活菌液組，同時ELISA檢測蛋白水平亦高于免疫正常接種滅活菌液組。提示機體對卡氏支孢霉感染的防御機制中有MIP-2、MCP-1參與。MacCallum DM在系統(tǒng)性白念株菌小鼠感染中亦發(fā)現(xiàn) MIP-2、MCP-1 明顯增加［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)免疫正常接種活菌組MIP-2、MCP-1基因表達和蛋白水平7 d時明顯高于本組30 d、60 d，呈下降趨勢;7 d時免疫正常接種活菌組MIP-2基因表達水平明顯高于免疫抑制組。與MIP-2表達水平變化相一致的是，各組皮損處病理早期表現(xiàn)均以中性粒細胞聚集為主，尤以免疫正常接種活菌組明顯。這提示在著色真菌感染早期MIP-2起著趨化中性粒細胞至感染部位清除真菌的作用。各組小鼠病理后期呈慢性炎癥表現(xiàn)，以單核巨噬細胞為主，故在后期即30 d、60 d時起主導(dǎo)作用的趨化性細胞因子不應(yīng)是MIP-2。免疫正常接種活菌組MIP-2基因表達和蛋白水平30 d、60 d時較7 d時明顯下降，且二者之間無明顯差異，這與病理表現(xiàn)是相一致的。與本研究結(jié)果相符的是，Guillot等對副球孢子菌系統(tǒng)感染小鼠的研究結(jié)果亦支持MIP-2在真菌感染中的保護作用［12］。Huffnagle等［13］研究發(fā)現(xiàn)MIP基因敲除小鼠的白細胞聚集能力及腦隱球菌清除能力均較野生型小鼠下降，并提出須趨化性細胞因子聚集效應(yīng)細胞參與的Th1型細胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌為宿主防御機制的觀點。

免疫正常組MCP-1表達水平7 d時明顯高于30 d、60 d，呈下降趨勢，7 d時免疫正常組MCP-1表達水平明顯高于免疫抑制接種菌液及滅活菌液組，但在本動物模型發(fā)病早期各組小鼠病理切片中炎癥細胞以中性粒細胞為主，后期則呈慢性炎癥表現(xiàn)，以單核巨噬細胞為主，并不能體現(xiàn)出上述MCP-1基因表達水平的曲線和差異。因此，尚且不能明確MCP-1在著色真菌病病程中具體發(fā)揮的作用。

本研究結(jié)果表明在卡氏支孢霉所致著色真菌病模型的發(fā)病過程中有MCP-1、MIP-2這兩種趨化性細胞因子的參與。感染早期病灶處大量中性粒細胞聚集可能與局部細胞高分泌具趨化作用的MIP-2所致，而MCP-1在著色真菌病病程中具體發(fā)揮的作用尚不清楚，有待于進一步研究。本研究結(jié)果提示在著色真菌感染初期可以將MIP-2作為靶目標，在抗真菌藥治療的基礎(chǔ)上，予以促進MIP-2分泌的細胞因子或直接給予MIP-2，以促進中性粒細胞在感染局部病灶處的聚集從而增強其對病原真菌的吞噬作用，或許可以取得更好的臨床治療效果。

［1］ Pina A，Bernardino S，Calich VL.Alveolar macrophages from susceptible mice are more competent than those of resistant mice to control initial Paracoccidioides brasiliensis infection［J］.J Leukoc Biol，2008，83(5):1088-1099.

［2］ Hayakawa M，Ghosn EE，da Gloria Teixeria de Sousa M，et al.Phagocytosis，production of nitric oxide and pro-inflammatory cytokines by macrophages in the presence of dematiaceous［correction of dematiaceus］fungi that cause chromoblastomycosis［J］.Scand J Immunol，2006，64(4):382-387.

［3］ Sousa MG，de Maria Pedrozo e Silva Azevedo C，Nascimento RC，et al.Fonsecaea pedrosoi infection induces differential modulation of costimulatory molecules and cytokines in monocytes from patients with severe and mild forms of chromoblastomycosis［J］.J Leukoc Biol，2008，84(3):864-870.

［4］ Jiang Y，Russell TR，Graves DT，et al.Monocyte chemoattractant protein 1 and interleukin-8 production in mononuclear cells stimulated by oral microorganisms［J］.Infect Immun，1996，64(11):4450-4455.

［5］ Filler SG，Pfunder AS，Spellberg BJ，et al.Candida albicans stimulates cytokine production and leukocyte adhesion molecule expression by endothelial cells［J］.Infect Immun，1996，64(7):2609-2617.

［6］ Schaller M，Mailhammer R，Grassl G，et al.Infection of human oral epithelia with Candida species induces cytokine expression correlated to the degree of virulence［J］.J Invest Dermatol，2002，118(4):652-657.

［7］ Schelenz S，Smith DA，Bancroft GJ.Cytokine and chemokine responses following pulmonary challenge with Aspergillus fumigatus:obligatory role of TNF-alpha and GM-CSF in neutrophil recruitment［J］.Med Mycol，1999 ，37(3):183-194.

［8］ Goldman D，Song X，Kitai R，et al.Cryptococcus neoformans induces macrophage inflammatory protein 1alpha(MIP-1alpha)and MIP-1beta in human microglia:role of specific antibody and soluble capsular polysaccharide［J］.Infect Immun，2001，69(3):1808-1815.

［9］ Souto JT，Aliberti JC，Campanelli AP，et al.Chemokine production and leukocyte recruitment to the lungs of Paracoccidioides brasiliensis-Infected mice is modulated by interferon-gamma［J］.Am JPathol，2003，163(2):583-590.

［10］ Kudeken N，Kawakami K，Saito A.Cytokine-induced fungicidal activity of human polymorphonuclear leukocytes against Penicillium marneffei［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，1999 ，26(2):115-124.

［11］ MacCallum DM，Castillo L，Brown AJ，et al.Early-expressed chemokines predict kidney immunopathology in experimental disseminated Candida albicans infections［J］.PLoSOne，2009，4(7):6420.

［12］ Guillot L，Carroll SF，Homer R，et al.Enhanced innate immune responsiveness to pulmonary Cryptococcus neoformans infection is associated with resistance to progressive infection［J］.Infect Immun，2008，76(10):4745-4756.

［13］ Huffnagle GB，McNeil LK.Dissemination of C.neoformans to the central nervous system:role of chemokines，Th1 immunity and leukocyte recruitment［J］.J Neurovirol，1999，5(1):76-81.