中藥雙龍片對實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌梗塞的治療作用

高 榮， 劉清飛， 李貽奎， 史 俊， 王義明， 羅國安*

（1.清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084;2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，北京 100084;3.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091;4.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237）

雙龍方是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，經(jīng)過長期實(shí)驗(yàn)研究及對比精選所得的中藥復(fù)方，由丹參和人參兩味藥材組成，具有“益氣養(yǎng)血、活血通脈”功能，主治“胸痹”（氣虛血瘀型），適用于冠心病（心絞痛、心肌梗塞）。藥理研究表明雙龍方對心肌梗塞模型大鼠有明顯的治療作用［1］。但雙龍方為傳統(tǒng)的湯劑，服用不便，為此，我們提取人參和丹參藥材中的有效部分人參總皂苷和丹參總酚酸，按雙龍方的藥材配比制成片劑雙龍片。本實(shí)驗(yàn)以大鼠冠狀動脈結(jié)扎致心肌梗塞模型，通過心肌梗塞面積測定、血清酶學(xué)指標(biāo)測定及梗塞區(qū)邊緣血管面密度測定來研究雙龍片對心肌梗塞的治療作用，并為今后的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

Wistar大鼠，SPF 級，♂性，體重 210 ～230 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供（SCXK（京）2007－0001）。

1.2 藥物與試劑

雙龍片，自制，批號:20090313;麝香保心丸上海和黃藥業(yè)有限公司，批號:081106;鹽酸地爾硫?片，浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號:080903;肌酸激酶（CK）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號:20090326;乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號:20090326;Ⅷ因子兔多克隆抗體，購自美國R＆D公司，批號:V58401;羊抗兔IgG二抗，北京中杉金橋公司，批號:PV－6000;CMC－Na，北京華奇盛生物技術(shù)發(fā)展中心，批號:A10648;水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:T20061114;甲醛，北京益利精細(xì)化工公司，批號:20080728。

1.3 儀器

LeicaRM2145切片機(jī)，德國 Leica公司生產(chǎn);Olympus bx51光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn);Anymicro DSS圖像分析系統(tǒng)，北京裕天世紀(jì)偉業(yè)公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動物造模［2］

140只大鼠實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)2 d后，用3.5%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，胸部去毛消毒，沿著鎖骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第3或第4肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟。在動脈圓錐與左心耳之間、左心耳根下部2～3 mm處穿線，結(jié)扎冠狀動脈處左冠狀動脈前降支后，把心臟放回胸腔，擠壓排除胸腔空氣，撒入約20萬單位的青霉素凍干粉，迅速縫合胸腔。假手術(shù)組除不結(jié)扎冠脈前降支外其余操作同模型組。

2.2 分組及給藥

將手術(shù)后麻醉蘇醒的76只冠脈結(jié)扎大鼠，隨機(jī)分為6組，每組12～13只:雙龍片高、中、低劑量組（給藥劑量分別相當(dāng)于5 g生藥/kg、2.5 g生藥/kg、1.25 g生藥/kg，片劑研磨成細(xì)粉后用0.5%CMCNa溶液分別配置成混懸液）;陽性對照藥麝香保心丸組（50 mg/kg，丸劑研磨成細(xì)粉后用0.5%CMCNa溶液配置成混懸液）;陽性對照藥鹽酸地爾硫?片組（50 mg/kg，片劑研磨成細(xì)粉后用0.5%CMCNa溶液配混懸液）;模型對照組（給予10 mL/kg的0.5%CMC－Na溶液）。另外將假手術(shù)后麻醉蘇醒的開胸大鼠10只作為假手術(shù)組，10只未做任何處理的大鼠作為正常對照組，均給予10 mL/kg的0.5%CMC－Na溶液。以上各組大鼠在手術(shù)后第2天開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14 d。14 d后麻醉大鼠，開腹取下腔靜脈血，離心分離血清備用;后開胸取心臟，生理鹽水洗凈后立即用10%的福爾馬林固定。

2.3 血清酶學(xué)測定

取大鼠血清，分別按肌酸激酶（CK）測定試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒的要求進(jìn)行測定，并計(jì)算CK和LDH的活力值。

2.4 心肌病理觀察及梗塞面積測定

取固定后大鼠心臟，沿左室短軸橫切5片，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、每片用石蠟包埋制蠟塊，制成5 μm厚的切片、蘇木素－伊紅（H－E）染色，光鏡下觀察心肌壞死情況。用Anymicro DSS圖像分析系統(tǒng)在10倍物鏡顯微鏡下檢測每個切片的左室面積和心肌梗塞面積（梗塞區(qū)與非梗塞區(qū)的界定為:梗死灶邊緣可見充血帶及中性粒細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物及不規(guī)則橫帶），計(jì)算心肌梗塞總面積與左室總面積，梗塞面積（%）用心肌梗塞總面積/左室總面積×100%表示。

2.5 梗塞邊緣區(qū)心肌血管面密度檢測

取2.4項(xiàng)操作所制第3片心肌的蠟塊，制成5 μm厚的切片，按標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)進(jìn)行心肌組織VⅢ因子免疫組化染色操作，其切片經(jīng)Anymicro DSS圖像分析系統(tǒng)處理，測量左室梗塞邊緣區(qū)顯示有VⅢ因子陽性染色的血管（×200）數(shù)目，每張切片隨機(jī)觀察5個視野，取均數(shù)，再根據(jù)測量窗面積即可算出每平方毫米的血管數(shù)目即面密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 造模及動物死亡情況

本次實(shí)驗(yàn)共用去150只大鼠，其中140只造心肌梗死模型和開胸做假手術(shù)，手術(shù)后造模大鼠存活76只，假手術(shù)大鼠存活10只。造模存活的76只大鼠中，分配到模型對照組13只，飼養(yǎng)過程中死亡5只;分配到雙龍片高劑量組13只，飼養(yǎng)過程中死亡2只;分配到雙龍片中劑量組13只，飼養(yǎng)過程中死亡4只;分配到雙龍片低劑量組13只，飼養(yǎng)過程中死亡4只;分配到麝香保心丸組12只，飼養(yǎng)過程中死亡1只;分配到鹽酸地爾硫?組12只，飼養(yǎng)過程中死亡5只。正常對照組10只和假手術(shù)組10只大鼠均未死亡。

3.2 雙龍片對血清CK、LDH的影響 見表1。

表1 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠的血清酶學(xué)CK、LDH的影響（±s）

表1 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠的血清酶學(xué)CK、LDH的影響（±s）

與模型對照組相比，*P ＜0.05，**P＜0.01;與正常對照組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/（g/kg） 樣本量/個 CK/（U/L） LDH/（U/L）模型對照組 — 9 2 152.2±433.5## 15 595.1±2 748.3##正常對照組 — 10 806.6±531.1 8 278.9±3 196.6假手術(shù)組 — 10 1 364.6±353.4**# 8 821.1±4 071.7**雙龍片高劑量組 5 11 856.2±322.7** 9 019.1±2 204.2**雙龍片中劑量組 2.5 9 929.1±662.4** 10 935.7±2 403.2**雙龍片低劑量組 1.25 9 1 397.5±840.0* 11 555.6±3 742.3**麝香保心丸組 0.05 11 1 263.8±603.3** 11 885.2±5 131.0*鹽酸地爾硫?組 0.05 7 1 368.2±389.2** 12 430.8±1 693.3*

結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型對照組 LDH、CK值顯著升高（P＜0.01），說明冠狀動脈結(jié)扎所致的心肌梗塞可導(dǎo)致大鼠血清中的LDH、CK的活性顯著升高，造模成功;假手術(shù)組的CK值與模型對照組和正常對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明開胸手術(shù)能夠顯著升高CK活性，但其升高程度不如冠脈結(jié)扎;與模型對照組相比，各給藥組 LDH、CK值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與正常對照組相比各給藥組的LDH、CK值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各給藥組相互之間的LDH、CK值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），以上說明各劑量的雙龍片均能夠?qū)⒐诿}結(jié)扎大鼠的LDH及CK活性降至正常水平的作用，其療效與陽性對照藥麝香保心丸相當(dāng)。

圖1 心肌梗塞模型大鼠治療組、對照組及假手術(shù)組的心肌病理切片

3.3 心肌病理觀察

結(jié)果見圖1:模型組梗塞區(qū)心肌細(xì)胞重度水腫，見灶狀、片狀壞死，纖維化，鈣化，間質(zhì)水腫，大量炎細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)出血明顯，提示造模成功;假手術(shù)組從整體來看心肌細(xì)胞橫紋排列整齊，心肌細(xì)胞橫紋肌和細(xì)胞核正常，但有少量炎細(xì)胞浸潤，可能為心臟穿孔留線所致。雙龍片各劑量組及兩陽性藥對照組病理改變介于模型對照組和假手術(shù)組之間，其中雙龍片高劑量組與麝香保心丸組心肌病理改變狀況明顯輕于其他給藥組。

3.4 心肌梗塞面積

結(jié)果見表2。雙龍片各劑量組與陽性對照藥麝香保心丸組的心肌梗塞面積均小于模型對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明雙龍片各劑量和麝香保心丸均有改善心肌梗塞面積的作用;陽性對照藥鹽酸地爾硫?有縮小心肌梗塞面積的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明其改善心肌梗塞的的療效不如雙龍片和麝香保心丸;假手術(shù)組無梗塞面積。

表2 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠心肌梗塞面積的影響（±s）

表2 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠心肌梗塞面積的影響（±s）

與模型對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與鹽酸地爾硫?相比，#P ＜0.05。

組別 劑量/（g/kg）樣本量/個 梗塞面積/%模型對照組 —9 22.04±3.84假手術(shù)組 — 10 0雙龍片高劑量組 5 11 9.16±1.37**#雙龍片中劑量組 2.5 9 9.43±2.32**雙龍片低劑量組 1.25 9 11.14±4.38*麝香保心丸組 0.05 11 9.68±0.67**鹽酸地爾硫?組0.05 7 16.05±3.71

3.5 梗塞邊緣區(qū)心肌血管面密度

結(jié)果見表3，模型對照組與假手術(shù)組相比，梗塞邊緣區(qū)心肌血管面密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明心肌梗塞后尚不能自發(fā)形成代償性血管新生;各給藥組梗塞邊緣區(qū)心肌血管面密度均高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明雙龍片各劑量與兩個陽性對照藥均有促進(jìn)梗塞區(qū)心肌血管新生的作用;而雙龍片高劑量組與麝香保心丸組心肌血管面密度均高于鹽酸地爾硫?組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明雙龍片高劑量與麝香保心丸的促血管新生作用要強(qiáng)于鹽酸地爾硫?，雙龍片中低劑量促血管新生作用與鹽酸地爾硫?相當(dāng)。

4 討論

急性心肌梗塞的診斷基于WHO的標(biāo)準(zhǔn)，包括下列三項(xiàng)中的二項(xiàng)——臨床癥狀、心電圖異常和血清中LDH、CK及其同工酶異常。心肌梗塞后心肌嚴(yán)重缺血、缺氧使細(xì)胞內(nèi)的LDH、CK釋放入血循環(huán)，造成血中LDH、CK活性明顯升高，其升高程度與心肌壞死程度呈正比，故可通過測定血清中LDH、CK的的活性反應(yīng)心肌組織受損情況［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙龍片各劑量組均能顯著降低冠脈結(jié)扎致心肌梗塞大鼠的LDH及CK活性，從而對缺血心肌具有保護(hù)作用。

表3 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠梗塞邊緣區(qū)新生血管的影響（±s）

表3 雙龍片對心肌梗塞模型大鼠梗塞邊緣區(qū)新生血管的影響（±s）

與模型對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與鹽酸地爾硫?組相比，#P ＜0.05。

組別 劑量/（g/kg）樣本量/個 心肌血管面密度/（個/mm2）模型對照組 —9 51.1±18.3假手術(shù)組 — 10 50.2±12.9雙龍片高劑量組 5 11 111.5±13.3**#雙龍片中劑量組 2.5 9 86.8±13.3**雙龍片低劑量組 1.25 9 97.9±13.5**麝香保心丸組 0.05 11 114.9±3.0**#鹽酸地爾硫?組 0.05 7 77.5±9.7*

有文獻(xiàn)報(bào)道在研究大鼠心肌梗塞模型時，假手術(shù)組的心肌病理鏡下觀察也出現(xiàn)了少部分心肌壞死，出現(xiàn)了假陽性的心肌梗塞區(qū)，其原因是其采用頸椎脫臼法處死大鼠后心臟仍然跳動，心肌缺氧而導(dǎo)致部分心肌壞死［4］。本研究是在大鼠麻醉狀態(tài)下活體取心臟并立即用福爾馬林固定，假手術(shù)組并未觀察到心肌壞死現(xiàn)象，從而避免了假陽性的心肌梗塞的發(fā)生。

冠脈側(cè)枝循環(huán)的建立能減輕心肌缺血壞死、預(yù)防和延緩缺血性心臟病和室壁瘤形成、改善臨床癥狀和預(yù)后，它包括原有側(cè)枝的開放和新側(cè)枝的形成。血管面密度是直接反映側(cè)枝血管形成最可靠的解剖學(xué)指標(biāo)，梗塞范圍也間接反映側(cè)枝循環(huán)情況，梗塞面積越小，說明側(cè)枝循環(huán)越豐富［5］。已有研究表明，麝香保心丸能促進(jìn)冠脈側(cè)枝血管的生成，具有保護(hù)缺血心肌，減小梗塞范圍的作用［4，5］，本研究證實(shí)，雙龍片具有麝香保心丸的同等療效。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷中的單體成分Rg1、Re等具有血管生長因子樣作用［6，7］，這是雙龍片能促進(jìn)冠脈側(cè)枝循環(huán)的有力佐證。

雙龍片由丹參和人參藥材提取的有效部分丹參總酚酸和人參總皂苷組成，人參總皂苷有增加冠脈血流、減少心肌耗氧的作用，丹參總酚酸的主要組成成分丹參素有抗心肌缺血、抗血小板、抗血栓形成作用［1］，兩者合用可降低心肌耗氧，增加冠脈血流量等作用，使心肌能量消耗下降，有利于調(diào)節(jié)和維持心肌氧代謝和能量的供需平衡，改善心肌的血氧供應(yīng)，從而緩解心肌梗塞所致的心肌損害。

一般認(rèn)為，血液循環(huán)中的干細(xì)胞可以定向到達(dá)梗塞心肌并參與組織再生與微環(huán)境（包括細(xì)胞因子及生長因子的分泌表達(dá)）有關(guān)，即“環(huán)境誘導(dǎo)分化”理論，同時新生的心肌細(xì)胞通過分泌某些細(xì)胞因子及生長因子進(jìn)一步改善心臟的灌注和功能［8］，雙龍片的主要成分人參皂苷Rb1和丹參酚酸B能夠誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞［9］，從而修復(fù)梗死心肌，減少梗塞面積，達(dá)到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)和提高心臟功能的目的。

本研究結(jié)果表明，雙龍片可降低冠狀動脈結(jié)扎大鼠的血清CK、LDH酶學(xué)活性，減輕心肌損傷程度，修復(fù)梗塞區(qū)心肌從而縮小心肌梗塞范圍，同時可促進(jìn)梗塞邊緣區(qū)心肌小血管生成，增加心肌供血，證明雙龍片對大鼠冠狀動脈結(jié)扎之心肌梗塞有明顯的治療作用。

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