Galectin-3在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義

陳啟光，楊琦，張哲，于秀月，單廣夷，孔垂?jié)?/p>

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

Galectins（β半乳糖凝集素）是生物體內(nèi)廣泛存在的一類糖苷結(jié)合蛋白，屬于凝集素家族。Galectins不僅存在于細(xì)胞質(zhì)，也存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有多種生物功能。迄今為止，人們已經(jīng)在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了15個Galectins家族成員，其中Galectin-3廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，參與多種生物學(xué)過程如細(xì)胞生長、黏附、分化、血管生成和凋亡等。最新的研究顯示，Galectin-3與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，如參與血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等。因而其生物學(xué)功能受到廣泛關(guān)注。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位。Galectin-3在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不明確。本研究應(yīng)用S-P免疫組化檢測膀胱癌患者標(biāo)本中Galectins-3的表達(dá)，探討其表達(dá)量與臨床分級、病理分級之間的關(guān)系，為臨床正確評估預(yù)后和指導(dǎo)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

45例膀胱癌手術(shù)切除標(biāo)本和6例正常膀胱標(biāo)本均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2007至2009年存檔標(biāo)本，膀胱癌組患者年齡31～84歲，平均56歲，其中男性32例，女性13例。初發(fā)膀胱癌35例，復(fù)發(fā)者10例；病理分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級17例，Ⅲ級10例。臨床分期：T1期22例，T2期17例，T3期6例。正常組年齡34～68歲，平均47歲。

1.2 實驗試劑

一抗Galectin-3鼠抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗及免疫組化SP試劑盒、二甲基聯(lián)苯胺（DBA）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，血清，3%雙氧水、磷酸鹽緩沖液（PBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、及蘇木素等均由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

1.3 試驗方法

石蠟包埋組織4μm厚連續(xù)切片，臨用前常規(guī)65℃烤60 min后二甲苯、乙醇脫蠟至水，3%雙氧水浸泡20 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。微波枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，降至室溫水洗后PBS洗3次每次5 min，滴加10%血清，阻斷非特異性結(jié)合，37℃孵育10 min。加一抗（工作濃度1∶200）4℃過夜，PBS洗3次每次5 min；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育10 min，PBS洗3次每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、干燥中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果判定方法：Galectin-3定位于細(xì)胞漿，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。采用陽性染色強度結(jié)合陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行判斷。染色強度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。高倍鏡下每張切片隨機觀察4個視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，1%～10%為1分；11%～50%為2分，51%～75%為3分；﹥75%為4分。兩項得分相乘，滿 3 分為“+”；4 分為“++”；5 分以上為“+++”，“+～+++”為陽性表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件行數(shù)據(jù)分析處理，采用χ2檢驗、Fisher′s精確概率法和Pearson相關(guān)分析進(jìn)行檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-3的表達(dá)及定位

免疫組化染色結(jié)果顯示Galectin-3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及間質(zhì)中亦有少量表達(dá)。在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率為62.2%（28/45），而在6例正常膀胱黏膜組織中均未見表達(dá)（圖1）。其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.116，P=0.006）。

2.2 Galectin-3的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征間的關(guān)系

45例膀胱癌組織中，Galectin-3在初發(fā)和復(fù)發(fā)膀胱癌中的陽性率分別為60%和70%，其間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。Galectin-3的陽性表達(dá)在不同分化組織標(biāo)本之間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其表達(dá)量隨膀胱癌組織的分化程度降低而增加，兩者間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.372，P=0.012）。在不同臨床分期的病例間，Galectin-3的表達(dá)差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其陽性表達(dá)率隨臨床分期的增加而增加（r=0.518，P＜0.01）。見表 1。

表1 Galectin-3在不同膀胱癌中的表達(dá)情況Tab.1 The correlation between Galectin-3 expression and clinicopathological parameters of bladder cancers

3 討論

Galectins是一類動物凝集素，它含有15個家族成員，它們通過與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的糖蛋白相互作用而發(fā)揮多種多樣的功能，如參與細(xì)胞生長、細(xì)胞黏附、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、及腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移等［1，2］。Galectin-3 是 Galectins家族的成員之一，研究表明，它是一個31 kDa的基因編碼產(chǎn)物，可與細(xì)胞表面基質(zhì)的糖蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)生、增殖、血管生成及轉(zhuǎn)移方面更扮有重要的角色［3］。目前國內(nèi)外對其在惡性膠質(zhì)瘤，肺癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，前列腺癌，腎癌及大腸癌方面進(jìn)行了一些研究，表明其在這些腫瘤組織中呈顯著高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［4~7］。到目前為止，國內(nèi)外對Glactin-3在膀胱癌中的研究卻很少。

本研究應(yīng)用免疫組化法檢測Galectin-3在膀胱癌中的表達(dá)，結(jié)果表明其在膀胱癌中的陽性表達(dá)率為62.2%，而在正常膀胱黏膜中均未見表達(dá)。因而我們認(rèn)為Galectin-3與膀胱癌的發(fā)生可能有一定的關(guān)系，而且可作為膀胱癌的一個潛在診斷標(biāo)記物。Cindolo等［8］應(yīng)用RT-PCR方法檢測Galectin-1和Galectin-3在膀胱癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Galectin-1在膀胱癌中呈高表達(dá)且隨病理分級的增加而增高，而Galecin-3的表達(dá)亦增加，但其表達(dá)量在不同分化的組織中無明顯差異，同時Sakaki等［9］用ELISA法檢測膀胱癌患者血液中Galectin-3的含量，結(jié)果顯示與正常對照相比，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，但其表達(dá)量亦和膀胱癌的病理分級和臨床分期間無相關(guān)性。而我們的研究表明Galectin-3與初發(fā)和復(fù)發(fā)性膀胱癌中的陽性表達(dá)量無顯著性差異，但結(jié)果顯示其陽性表達(dá)率不僅和組織分化有關(guān)亦和臨床分期有關(guān)，其表達(dá)量隨分化程度的降低而升高，隨臨床分期的增加而增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因而需進(jìn)一步的研究與探討。Langbein等［10］的研究表明 Galectin-1，-2，-3 和-8 在膀胱癌中均呈高表達(dá)，與膀胱癌的病理分級和死亡率之間存在相關(guān)性，因而，他們不僅可以作為一個潛在的分子標(biāo)記物，而且可作為膀胱癌治療的一個靶點。然而Kramer等［11］通過研究Galectin-3在非侵潤性膀胱癌中的表達(dá)情況，認(rèn)為Galectin-3的表達(dá)下調(diào)或缺失在膀胱癌的產(chǎn)生中起作用，而且可作為膀胱癌高復(fù)發(fā)性群體的一個重要生物學(xué)指標(biāo)。Galectin-3在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中究竟起到什么樣的作用仍需進(jìn)一步深入研究。

總之，我們的研究表明Galectin-3在正常膀胱黏膜組織中未見表達(dá)，而在膀胱癌中有表達(dá)，且其表達(dá)量和病理分級及臨床分期間有相關(guān)性，有望作為膀胱癌的一個早期診斷，臨床病理分級及預(yù)后評估的重要指標(biāo)。但其在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中究竟起到什么樣的作用尚待進(jìn)一步研究。

［1］Yang RY，Liu FT．Galectinsincell and apoptosis［J］．Cell Mol Life Sci，2003，60（2）：267-276．

［2］Liu FI，Patterson RJ，Wang JL．Intracelular functions of galeetins［J］．Biochim Biophys Acta，2002，1572（2-3）：263-273．

［3］BarondesSH，Cooper DN，Gitt MA，etal.Galectins.structureand functionofalargefamilyofanimallectins［J］.JBiol Chem，1994，269（33）：20807-20810.

［4］Liu FT，Rabinovich GA.Galectins as modulators of tumour progression［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（1）：29-41.

［5］Inohara H，Honjo Y，Yoshii T，et al.Expression of galectin-3 in fineneedle aspirates as a diagnostic marker differentiating benign from malignant thyroid neoplasms［J］.Cancer，1999，85（11）：2475-2484.

［6］張巖，佟盛春，王永來，等.galectin-3在子宮內(nèi)膜病變中表達(dá)的研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，37（5）：701-703..

［7］van den Brule FA，Waltregny D，Liu FT，et al.Alteration of the cytoplasmic/nuclear expression pattern of galectin-3 correlates with prostate carcinoma progression［J］.Int JCancer，2000，89（4）：361-367.

［6］Sakaki M，F(xiàn)ukumori T，F(xiàn)ukawa T，et al.Clinical significance of Galectin-3 in clear cell renal cell carcinoma［J］.JMed Invest，2010，57（1-2）：152-157.

［8］Cindolo L，Benvenuto G，Salvatore P，et al.Galectin-1 and galectin-3 expressioninhumanbladder transitional-cellcarcinomas［J］.Int JCancer，1999，84（1）：39-43.

［9］Sakaki M，Oka N，Nakanishi R，et al.Serumlevel of galectin-3 in human bladder cancer［J］.JMed Invest，2008，55（1-2）：127-132.

［10］Langbein S，Brade J，Badawi JK，et al.Gene-expression signature of adhesion/growth-regulatory tissue lectins（galectins）in transitional cell cancer and its prognostic relevance［J］.Histopathology，2007，51（5）：681-690.

［11］Kramer MW，Kuczyk MA，Hennenlotter J，et al.Decreased expression of galectin-3 predicts tumour recurrence in pTa bladder cancer［J］.Oncol Rep，2008，20（6）：1403-1408.