同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERK調(diào)節(jié)作用與上皮生長因子受體的間接激活

楊軍，萬里姝，彭亮，任艷

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸的代謝產(chǎn)物。嚴重的高同型半胱氨酸血癥患者可存在神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)異常。近年來，Hcy的神經(jīng)毒性越來越引起了人們的重視。研究表明，Hcy水平的升高可能與Alzheimer病相關(guān)［1］，也有人認為高同型半胱氨酸血癥可能是老年認知障礙的一個早期標(biāo)志［2，3］。Hcy引起神經(jīng)元損傷的機制目前尚不完全清楚，可能與興奮谷氨酸受體，引起氧化反應(yīng)，DNA修復(fù)功能損害［4］有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠胚胎皮層神經(jīng)元等多種細胞及半胱氨酸β合成酶缺陷大鼠海馬切片的同型半胱氨酸毒性試驗中都發(fā)現(xiàn)有激活的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）存在［5］，提示Hcy可能誘導(dǎo)了ERK激活，但其具體機制目前尚不清楚。本研究利用原代培養(yǎng)的CD-1小鼠小腦顆粒神經(jīng)元，檢測了Hcy誘導(dǎo)下的ERK1/2磷酸化，并觀察了神經(jīng)細胞ERK上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）特異性抑制劑AG1478能否對其產(chǎn)生抑制，探討了Hcy與EGFR間接激活信號傳導(dǎo)途徑之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

7 d齡CD-1小鼠，體質(zhì)量約3.6 g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學(xué)臨床藥理教研室提供。AG1478（Cal－Biochem，美國），抗 ERK、P-ERK 特異性抗體、羊抗鼠 IgGHRP 二抗（Santa Cruz，美國），L-Hcy、碘化丙錠、DMEM、阿糖胞苷（Sigma，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腦顆粒神經(jīng)元原代培養(yǎng)：將小鼠置于75℅乙醇中，斷頸后取出腦組織，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在解剖顯微鏡下剝離出小腦，用無 Ca2+、Mg2+的 Hank′s液洗滌 2 次，切碎成糊狀，加入0.002%胰蛋白酶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1 500 r/min離心后棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液4℃下混勻后過濾，將濾得的細胞加入事先鋪以多聚賴氨酸的平皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min，待小腦顆粒神經(jīng)元細胞貼壁后，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 1.5 ml。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。加入阿糖胞苷（40μmol/L），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并每日觀察。

1.2.2 分組：將培養(yǎng)7 d的小腦顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液后，隨機分為4組：（1）生理鹽水對照組：加入生理鹽水培養(yǎng)20 min；（2）AG1478對照組：加入 AG1478（1 mmol/L）培養(yǎng) 20 min；（3）Hcy處理組：加入 Hcy（0.1 mmol/L）培養(yǎng) 20 min；（4）AG1478+Hcy處理組：先加入 AG1478（1 mmol/L）預(yù)處理15 min后，再加入Hcy（0.1 mmol/L）培養(yǎng)20 min。

1.2.3 Western blot：收集各組細胞，提取蛋白，Bradford方法進行蛋白定量。取50 mg蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入抗p-ERK或ERK一抗于室溫中孵育2 h。PBS洗膜4次。加入羊抗鼠（p-ERK）IgGHRP二抗孵育。ECL顯色成像。用Window AlPhaEase TMFC 32-bit分析軟件進行色帶灰度分析。實驗重復(fù)4次，所得結(jié)果取均值。

將原代培養(yǎng)7 d的小腦顆粒神經(jīng)元置于含有Hcy 0.1 mmol/L的無血清培養(yǎng)液中，37℃孵育10、20、40、60 min，采用 Western blot法測定 ERK 磷酸化情況并繪制時間曲線。

1.2.4 流式細胞儀分析細胞凋亡率：各組細胞藥物處理6 h后，將細胞輕輕吹起，1 500 r/min離心后收集細胞。PBS沖洗，再次1 500 r/min離心，棄上清，加入75%乙醇保存過夜。1 500 r/min離心，棄上清，PBS沖洗，1 500 r/min離心后棄上清，加入碘化丙錠（10 mg/ml），37℃孵箱內(nèi)孵育30 min，流式細胞儀（BD公司，美國）檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)4次，結(jié)果取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)用x±s表示。多組資料用One-Way ANOVA方法進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy引起小鼠小腦顆粒神經(jīng)元ERK磷酸化（圖1）

Western blot結(jié)果顯示，Hcy能夠引起小鼠小腦顆粒神經(jīng)元ERK磷酸化，且在Hcy處理20 min時，ERK1/2磷酸化最明顯。

2.2 EGFR特異性拮抗劑AG1478可阻斷Hcy誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化反應(yīng)（圖2）

Western blot結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組和AG1478對照組相比，Hcy處理組小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中磷酸化的ERK1/2明顯增加（P<0.05），而經(jīng)過AG1478預(yù)處理15 min后再加入Hcy的AG1478+Hcy處理組則未見統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 AG1478可促進Hcy誘導(dǎo)的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡

在培養(yǎng)7 d的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中加入Hcy 6 h后，通過流式細胞儀可以檢測到明顯的細胞凋亡；AG1478+Hcy處理組當(dāng)加入AG1478行預(yù)處理15 min后再加入Hcy 6 h時所檢測到的細胞凋亡率明顯高于單純Hcy處理組（P<0.05）；生理鹽水對照組和AG1478對照組則未見明顯細胞凋亡（圖3）。

3 討論

研究表明α2A-腎上腺激動劑主要通過兩種途徑引起ERK磷酸化［6］：一種是直接導(dǎo)致ERK磷酸化；另一種是通過兩步間接激活：（1）Gi蛋白通過酪氨酸激酶激活β、γ亞基，導(dǎo)致金屬蛋白酶促進上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）膜外部份脫落；（2）釋放的EGF間接激活自身和相鄰的EGFR，形成Grb2-Sos1復(fù)合物，導(dǎo)致ERK磷酸化。不同類型細胞不同G蛋白耦聯(lián)受體均存在間接激活途徑，最具代表性的是EGFR的間接激活途徑。1997年首次證實G蛋白耦聯(lián)受體激動劑能夠誘導(dǎo)ERK的活性，而EGFR特異性拮抗劑AG1478能夠抑制其活性［7］。這是細胞對外界刺激調(diào)節(jié)自身功能的一種新穎的方式。

Hcy與EGFR間接激活的相關(guān)性目前尚不清楚。有研究證明，Hcy可以引起ERK1/2的磷酸化，且Hcy可作用于谷氨酸受體引起神經(jīng)細胞興奮性毒性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR特異性拮抗劑AG1478可以阻斷原代培養(yǎng)的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元內(nèi)Hcy激活的ERK1/2信號傳導(dǎo)途徑，從而證明了Hcy通過激活EGFR最終導(dǎo)致ERK1/2磷酸化。

ERK1/2的間接激活對于膠質(zhì)細胞及其周圍神經(jīng)元的功能有重要作用。α2A-腎上腺激動劑激活星形膠質(zhì)細胞β、γ亞基，導(dǎo)致金屬蛋白酶促進HB-EGF膜外部份脫落，進而間接激活自身及相鄰細胞如神經(jīng)元上的EGFR，從而激活ERK磷酸化，這一過程被認為與細胞保護作用有關(guān)［8］。上皮生長因子廣泛存在于腦內(nèi)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，具有促進星形膠質(zhì)細胞和干細胞的增生、神經(jīng)形成［9］以及促進有絲分裂神經(jīng)元的生存和分化的功能［10］。

一般認為，EGFR的間接激活具有神經(jīng)保護作用，但關(guān)于Hcy引起的ERK1/2磷酸化是否具有神經(jīng)保護作用，目前尚無定論。Robert等［11］在半胱氨酸β合成酶缺陷大鼠海馬切片同型半胱氨酸毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化能減少海馬神經(jīng)元的凋亡，Pei等［12］則認為Hcy的谷氨酸興奮性毒性與凋亡無關(guān)。本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)7 d的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中加入Hcy 6 h后，通過流式細胞儀可以檢測到明顯的細胞凋亡；而當(dāng)加入AG1478行預(yù)處理15 min后再加入Hcy 6 h時所檢測到的細胞凋亡率明顯高于單純Hcy處理組（P<0.05），提示ERK1/2磷酸化可能具有潛在的神經(jīng)保護作用。

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