正交試驗(yàn)優(yōu)選清肝利膽膠囊醇提工藝

瀾蘭·艾則孜，帕依曼·亥米提，于寧（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊市 830054；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊市 830004）

清肝利膽膠囊是以藏醫(yī)理論組方的現(xiàn)代藏藥復(fù)方制劑，處方來源于藏藥臨床經(jīng)驗(yàn)方，筆者已按中藥、天然藥物6（2）類完成了所有臨床前的研究工作，現(xiàn)進(jìn)行臨床研究工作。本品處方由川西獐芽菜、波梭瓜子、唐古特烏頭、角茴香、兔耳草、苦買菜、訶子、甘草、大黃、金錢草、木香等12味藥材組成，具有祛濕除黃、清肝利膽和清熱解毒的功效。方中各藥分別被2005年版《中國藥典》（一部）、《部頒標(biāo)準(zhǔn)·藏藥分冊(cè)》和《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》收載。由于處方中大黃含蒽醌類有效成分[1]，唐古特烏頭和角茴香含有生物堿[2]，兔耳草、苦買菜和川西獐芽菜含有黃酮和皂苷類[3～5]，這些有效成分均有祛濕除黃、清肝利膽和清熱解毒等藥理作用[1～5]，因此，根據(jù)各藥材有效部位和有效成分的理化性質(zhì)，對(duì)這8味藥材選用乙醇提取。為將本方開發(fā)成可供臨床使用的工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可靠的現(xiàn)代藏藥復(fù)方制劑，筆者特對(duì)該復(fù)方進(jìn)行了醇提工藝研究，優(yōu)選出了合理可行的提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

Libror AEG-200型電子天平（日本島津公司）；SPD-10AVP型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-10ATVP二元高壓泵、SPD-10AVP紫外檢測(cè)器、CTO-10ASVP柱溫箱、SCL-10AVP系統(tǒng)控制器（日本島津公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9023A型恒溫箱（揚(yáng)州三發(fā)電子有限公司）。

1.2 試藥

大黃素、大黃酚對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為0756-200110、0796-200208）；甲醇為色譜純，HPLC用水為超純水，乙醇為藥用規(guī)格，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃總蒽醌的含量測(cè)定[6～8]

2.1.1 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為Shimadzu VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），檢測(cè)波長為254 nm，柱溫為35℃，流速為1.00 mL·min-1。理論塔板數(shù)按大黃峰計(jì)算應(yīng)＞3000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備：稱取大黃素、大黃酚對(duì)照品各適量，用甲醇（色譜純）制成含大黃素4μg·mL-1和大黃酚8μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備：稱取本品約1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加8%鹽酸20 mL，超聲處理5 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)舆m量甲醇微熱使溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，合并洗液至同一量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備：稱取按處方比例除大黃以外的其它醇提藥材，按清肝利膽膠囊醇提制備工藝制成陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.大黃素；2.大黃酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.emodin；2.chrysophanic acid

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取上述對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀。經(jīng)計(jì)算，大黃素的理論塔板數(shù) n＝5.54（tR/Wh/2）2＝12971，分離度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝1.65，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.97；大黃酚的理論塔板數(shù) n＝5.54（tR/Wh/2）2＝13103，分離度 R＝2（tR2－tR1）/（W1+W2）＝6.31，拖尾因子fs＝W0.05h/2d1＝0.96，均符合2005年版《中國藥典》的規(guī)定。在供試品的色譜圖中，對(duì)照品峰位與陰性對(duì)照沒有峰重疊，說明該法專屬性良好。色譜見圖1。2.1.6 線性關(guān)系考察：稱取大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇（色譜純）分別制成每1 mL含大黃素7.68μg和含大黃酚102μg的貯備溶液。分別精密量取上述大黃素對(duì)照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 mL，大黃酚對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得大黃素回歸方程為A＝33319C+1536.1（r＝0.9996），大黃酚回歸方程為A＝39750C+22239（r＝0.9993）。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚檢測(cè)濃度分別在0.768～3.84、2.04～16.32 μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2 乙醇浸出物量的測(cè)定

精密量取乙醇提取液100 mL，置已干燥至恒重并稱重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復(fù)3次，求得乙醇浸出物量。

2.3 正丁醇萃取物量的測(cè)定

精密量取乙醇提取液200 mL，加正丁醇萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分別為20 mL，全部置已干燥至恒重并稱重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復(fù)3次，求得正丁醇萃取物量。

2.4 三氯甲烷萃取物量的測(cè)定

精密量取乙醇提取液200 mL，加三氯甲烷萃取3次，第1次30 mL，第2、3次分別20 mL，全部置已干燥至恒重并稱重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)干，于105℃烘箱干燥3 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻，稱重，重復(fù)3次，求得三氯甲烷萃取物量。

2.5 正交試驗(yàn)[9，10]

根據(jù)單因素和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)，選擇乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）和乙醇用量（C）為考察因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)合常用分析方法和目前能夠得到有效成分對(duì)照品的情況，確定總蒽醌（即大黃素含量與大黃酚含量）、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量和乙醇浸出物量為指標(biāo)，綜合評(píng)分（權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.2、0.2、0.1），優(yōu)選最佳乙醇提取工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

綜合評(píng)分＝（總蒽醌/最大總蒽醌）×50%+（正丁醇萃取物量/最大正丁醇萃取物量）×20%+（三氯甲烷浸出物量/最大三氯甲烷萃取物量）×20%+（乙醇浸出物量/最大乙醇浸出物量）×10%。

按處方比例稱取各味醇提藥材，濾液定容，分別測(cè)定大黃總蒽醌、正丁醇萃取物量、三氯甲烷萃取物量、乙醇浸出物量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小順序?yàn)椋篈（乙醇濃度）＞B（提取時(shí)間）＞C（加醇量）；每個(gè)因素三個(gè)水平之間的趨勢(shì)為 A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1；直觀分析得提取工藝為A3B2C2，即加8倍量80%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。采用方差分析進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表3。

由表3可知，A因素的影響具有顯著性（P＜0.05），B和C因素的影響均無顯著性（P＞0.05）。結(jié)合直觀分析結(jié)果，以A3B2C2組合為佳，即加8倍量80%乙醇提取2次，每次1.5 h。據(jù)此條件對(duì)川西獐芽菜、波梭瓜子等8味藥材進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，說明篩選出的最佳醇提工藝可行、合理、穩(wěn)定。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

3 討論

本研究建立了以HPLC法測(cè)定清肝利膽膠囊中總蒽醌含量的方法，為進(jìn)一步完善清肝利膽膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了準(zhǔn)確、簡便、可行的測(cè)定方法。

根據(jù)處方中甘草等其余藥材的藥理作用、有效成分和有效部位選定水提取法，選擇加水用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終確定最佳水提工藝為加8倍量水提取3次，每次1 h。按上述工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)3批，測(cè)定每步工藝指標(biāo)，證明本研究優(yōu)選得的水提工藝合理、穩(wěn)定、可行。故醇提工藝和水提工藝共同構(gòu)成了清肝利膽膠囊的提取工藝。

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