黃瓜果實(shí)成熟衰老過程中幾種物質(zhì)的變化0王志坤

秦智偉 周秀艷

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

衰老是植物生長發(fā)育、形態(tài)建成和對(duì)環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)中一個(gè)必要的、主動(dòng)的過程，是受內(nèi)外因子直接或間接影響的一種器官或組織逐步走向功能衰退和死亡的變化過程（沈成國，2001）。所有多分子有機(jī)體在發(fā)育的最后階段都要經(jīng)歷生理功能的降低，這個(gè)過程就是衰老，是一個(gè)由基因控制的、有序的過程。衰老包括形態(tài)、代謝和生理上的改變，蛋白質(zhì)和核酸的降解，以及新基因的表達(dá)等，這些變化又反過來影響著衰老的進(jìn)程。植物衰老的生理生化變化是生物體與環(huán)境及自身的新陳代謝過程中正常的生理反應(yīng)（Pennel & Lamb，1997），生理生化變化主要包括葉綠素（Fang et al.，1998）和蛋白質(zhì)（Lutts et al.，1996）、膜脂（Trippi & Thiamann，1983）和RNA等大分子的分解以及營養(yǎng)物質(zhì)再利用（Himelblau & Amasino，2001）等。

黃瓜（Cucumis sativus L.）是重要蔬菜品種之一。我國是世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國家，了解黃瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程對(duì)我國黃瓜生產(chǎn)、貯藏具有重要的理論和實(shí)踐意義。黃瓜是非呼吸躍變型果實(shí)，果實(shí)衰老后，營養(yǎng)物質(zhì)降解，品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響著果實(shí)的商品性。研究黃瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程，明確其衰老過程中各重要生理生化指標(biāo)的變化特性，對(duì)認(rèn)清黃瓜果實(shí)衰老機(jī)理，有效延緩果實(shí)衰老、延長果實(shí)貨架期具有重要意義。

本試驗(yàn)以兩個(gè)黃瓜品種作為試驗(yàn)材料，主要從膜脂過氧化和大分子降解以及營養(yǎng)物質(zhì)再利用角度去研究兩個(gè)黃瓜品種果實(shí)的衰老特性。

1 材料與方法

1.1 材料

以黃瓜品種D0313（授粉后25 d果皮變黃，第1雌花節(jié)位為第3～4節(jié)，葉片淺綠色，植株抗病性差）和649（授粉后35 d果皮變黃，第1雌花節(jié)位為第4～5節(jié)，葉片深綠色，植株抗病性強(qiáng)）為材料，種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 設(shè)計(jì)與管理

試驗(yàn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝中心進(jìn)行。2005年3月25日播種，4月2日分苗，5月2日黃瓜三葉一心時(shí)定植在塑料大棚內(nèi)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，5月22日黃瓜初花期開始授粉，掛牌標(biāo)記。選取長勢(shì)一致，同天授粉的黃瓜作為試驗(yàn)材料，每隔5 d取樣1次。

將每個(gè)瓜縱切成1/2、1/4、1/8，然后取其中一份的頭部、中部和尾部1 cm長的小塊切碎，混合均勻，用于各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定取3個(gè)瓜，3次重復(fù)。2006年3月在溫室內(nèi)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

果實(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法（王晶英 等，2002）；脂氧合酶（LOX）活性的測(cè)定參照Surrey（1963）的方法；谷氨酰胺合成酶（GS）活性的測(cè)定參照O’Neal和Joy（1973）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析用Excel和DPS 3.01數(shù)據(jù)處理軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中外觀形態(tài)的變化

兩個(gè)黃瓜品種成熟衰老過程中果實(shí)外觀形態(tài)變化不盡相同。試驗(yàn)中，D0313果實(shí)停止生長的時(shí)間較649早7 d左右，兩個(gè)品種果皮顏色變黃的時(shí)間分別為授粉后25 d和35 d。整個(gè)發(fā)育過程，D0313果皮變黃速度明顯快于649，但果實(shí)中種子的發(fā)育進(jìn)程幾乎是同步，授粉后30d左右，果實(shí)內(nèi)種子開始成熟（種皮變硬，種胚發(fā)育完全），但D0313的種子飽滿度較同期649種子的飽滿度差一些。

2.2 黃瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中脂氧合酶活性變化

植物脂氧合酶（LOX）活性變化與組織衰老密切相關(guān)（羅云波，1994；陳昆松 等，1999；Fukuchi-Mizutani et al.，2000），以LOX催化的細(xì)胞膜過氧化作用可以形成氫過氧化物、自由基和茉莉酸（JA）等促進(jìn)衰老物質(zhì)（Grechkin，1998），直接或間接地參與了組織的衰老進(jìn)程。由于LOX可以形成茉莉酸等信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，啟動(dòng)膜脂過氧化作用，因此認(rèn)為是果實(shí)衰老早期鑒定指標(biāo)之一（宋德穎 等，2007），較其他生理指標(biāo)變化較早。本試驗(yàn)中兩個(gè)黃瓜品種的LOX活性變化趨勢(shì)相同（圖1）。授粉后15 d，LOX活性開始上升，授粉后20～25 d達(dá)到最大值，然后呈下降趨勢(shì)，在生育后期略有上升。在果實(shí)成熟衰老的過程中，D0313的LOX活性高于649，說明D0313啟動(dòng)膜脂過氧化作用的程度高于649。

2.3 果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化

可溶性蛋白質(zhì)含量和植物衰老關(guān)系密切。Halevy和Mayak（1981）認(rèn)為，蛋白質(zhì)含量下降是植物衰老的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖2可以看出，D0313可溶性蛋白質(zhì)含量在授粉后15～25 d變化不明顯；25 d以后下降顯著；到授粉后50d，可溶性蛋白質(zhì)含量僅為初期的22.01 %。649在授粉后15～30d可溶性蛋白質(zhì)含量變化也不明顯，30d后開始迅速下降，到授粉后50d可溶性蛋白質(zhì)含量為初期的44.06 %。無論是可溶性蛋白質(zhì)開始顯著下降的時(shí)間還是下降的速度，D0313都早于且快于649。

圖1 黃瓜果實(shí)成熟衰老過程中LOX活性變化

圖2 黃瓜果實(shí)成熟衰老過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化

2.4 黃瓜果實(shí)成熟衰老過程中谷氨酰胺合成酶活性變化

果實(shí)成熟衰老時(shí)，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解為氨基酸等小分子物質(zhì)，為氮素轉(zhuǎn)移提供條件。谷氨酰胺合成酶（GS）與內(nèi)源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨的再同化和氨的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，是衰老末期物質(zhì)再利用的體現(xiàn)。兩個(gè)品種 GS活性的變化趨勢(shì)大體相同（圖 3）。D0313授粉后15～35 d，649授粉后15～40d，GS活性基本維持不變，表明此階段果實(shí)內(nèi)部沒有發(fā)生物質(zhì)轉(zhuǎn)移及再利用；D0313授粉后35～40d，649授粉后40～45 d，GS活性急劇升高，說明此時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)后期的再利用迅速增多，而且也與大分子物質(zhì)劇烈降解時(shí)期基本吻合，此時(shí)黃瓜果實(shí)已進(jìn)入衰老后期。

圖3 黃瓜果實(shí)成熟衰老過程中GS活性變化

3 結(jié)論與討論

自由基衰老學(xué)說認(rèn)為，衰老過程即活性氧代謝失調(diào)累積的過程。膜脂過氧化作用及對(duì)其具有清除功能的抗氧化酶系統(tǒng)近年來成為植物衰老機(jī)理研究的重要方面之一。在正常情況下，形成的大部分會(huì)被SOD清除掉，使降低到一定的穩(wěn)態(tài)濃度。而在植物衰老過程中，自由基產(chǎn)生和清除反應(yīng)之間的平衡遭受破壞，SOD活性降低，保護(hù)系統(tǒng)受到消弱，濃度大大增加，引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用和膜脂脫脂化，膜脂過氧化的中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物 MDA都會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜（陳少裕，1991），細(xì)胞膜透性的變化可以反映出細(xì)胞受傷害的程度。由于膜完整性受到破壞，胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生滲漏，引起果實(shí)浸出液電導(dǎo)率的急劇增加。

李艷秋等（2006）測(cè)定了黃瓜果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中SOD、MDA和組織相對(duì)電導(dǎo)率的變化，結(jié)果表明授粉15 d時(shí)，D0313的SOD活性低于649；從20d開始，D0313的SOD活性快速上升；授粉后25 d，D0313的SOD活性開始下降。前期SOD活性的上升表明了植物自身對(duì)逆境的一種適應(yīng)能力，以維持體內(nèi)各種代謝之間的平衡。但在后期這種平衡遭到破壞，SOD活性降低，清除活性氧能力下降，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧積累而產(chǎn)生毒害，引起細(xì)胞膜過氧化破壞作用，果實(shí)快速衰老。D0313的MDA含量顯著高于649，二者變化趨勢(shì)較一致：前期積累緩慢，后期積累迅速，但D0313的 MDA含量上升速度顯著快于 649。MDA的積累是過氧化作用加劇、膜受到損傷的重要表現(xiàn)，其含量越高表明膜脂過氧化作用越強(qiáng)。因此，表明在果實(shí)衰老過程中，D0313果實(shí)清除自由基的能力較差，造成自由基對(duì)細(xì)胞的傷害程度大，這可能是其早衰的一個(gè)原因。黃瓜品種D0313和649的果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致，均呈上升趨勢(shì)，不同的是，D0313的相對(duì)電導(dǎo)率大于649，且上升速度變化快，表明D0313電解質(zhì)滲透較嚴(yán)重（李艷秋 等，2006）。

結(jié)合李艷秋等（2006）的研究內(nèi)容，本試驗(yàn)又選擇了啟動(dòng)膜脂過氧化作用的關(guān)鍵酶LOX進(jìn)行研究，結(jié)果表明，黃瓜果實(shí)授粉后15 d，LOX活性開始增加，說明此時(shí)膜脂過氧化作用開始啟動(dòng)，但由于保護(hù)酶SOD的活性氧清除作用，使果實(shí)的膜脂過氧化作用并沒有增強(qiáng)，MDA含量維持穩(wěn)定。直至授粉后30～35 d，果實(shí)SOD活性開始迅速下降，導(dǎo)致超氧化物自由基水平的上升，加劇了膜脂過氧化作用，MDA含量逐漸升高。膜脂過氧化程度的增加，導(dǎo)致膜完整性遭到破壞，胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生外滲，引起果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的急劇增加，授粉后35～40d，組織相對(duì)電導(dǎo)率迅速上升。果實(shí)相對(duì)電導(dǎo)率的迅速升高很可能是果實(shí)衰老后期失水的前奏，而RNA和蛋白質(zhì)降低才是衰老開始的標(biāo)志。這就是說在原生質(zhì)膜完整性破壞之前，衰老已經(jīng)開始。從前人對(duì)衰老的研究及本試驗(yàn)研究的結(jié)果看，膜脂過氧化是導(dǎo)致黃瓜果實(shí)衰老的主要生理原因之一。

國內(nèi)外不少學(xué)者都把可溶性蛋白質(zhì)含量作為衰老的重要指標(biāo)之一（Himelblau & Amasino，2001）。有研究表明，可溶性蛋白質(zhì)含量降解損失量占衰老過程中蛋白質(zhì)降解損失總量的90%～95 %，因此反映蛋白質(zhì)降解水平的一個(gè)重要指標(biāo)就是可溶性蛋白質(zhì)含量的變化（沈成國，2001）。本試驗(yàn)中兩個(gè)黃瓜品種可溶性蛋白質(zhì)含量先是保持穩(wěn)定，說明此階段蛋白質(zhì)合成與分解是平衡的，果實(shí)基本功能穩(wěn)定；授粉后25 d和30d，D0313和649的可溶性蛋白質(zhì)含量迅速下降，蛋白質(zhì)含量的大幅度下降，表明此時(shí)黃瓜果實(shí)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)開始迅速瓦解。

植物衰老的另外一種表現(xiàn)就是在衰老后期，對(duì)內(nèi)源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨的再同化和氨的運(yùn)轉(zhuǎn)，也就是在衰老末期物質(zhì)的再利用。在高等植物中，谷氨酰胺合成酶由于對(duì)氨的高親和力以及強(qiáng)有力地把氨滲入到有機(jī)酸中的能力，因此被認(rèn)為是氨同化的關(guān)鍵酶。GS催化產(chǎn)生的谷氨酰胺不僅是存貯蛋白降解產(chǎn)生的游離氨的受體，也是植物體內(nèi)氨轉(zhuǎn)運(yùn)的主要形式。GS活性與內(nèi)源性蛋白降解和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨的再同化和氨的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本試驗(yàn)中兩個(gè)黃瓜品種果實(shí)GS活性在授粉后35～40d開始迅速升高，而此時(shí)間也正是可溶性蛋白質(zhì)含量急劇下降的時(shí)期。

在不同的品種中除了本身的遺傳特性以及栽培地的環(huán)境條件不同外，還由于蛋白質(zhì)降解、膜脂過氧化和酶系統(tǒng)活性水平的差異，從而造成膜系統(tǒng)穩(wěn)定性不同，最終表現(xiàn)為果實(shí)衰老進(jìn)程的不同。這可能也解釋了本試驗(yàn)中黃瓜品種D0313比649早衰的原因。因此，通過對(duì)衰老特性的研究，采用一定的措施，增強(qiáng)酶活性、維持自由基產(chǎn)生與清除之間的平衡，可能是延長黃瓜果實(shí)衰老的有效途徑。

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