草莓果膠裂解酶RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建

錢春 何橋 翟軍鵬 宋波 夏蓓蓓 張興國(guó) 梁國(guó)魯

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

草莓（Fragaria ananassa Duch.）果實(shí)色澤鮮紅、柔軟多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，老少皆宜。防止草莓果實(shí)成熟軟化，延長(zhǎng)草莓果實(shí)貨架壽命，是草莓生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題。草莓屬典型的非躍變型果實(shí)（Knee et al.，1977；Perkins-Veazie et al.，1988），許多研究表明這類果實(shí)成熟軟化與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化及多糖（果膠、纖維素、半纖維素）的降解密切相關(guān)，軟化主要是由于皮層薄壁組織細(xì)胞壁胞間層的降解增加果膠釋放所致（Neal，1965；Knee et al.，1977；Abeles & Takeda，1990），果膠裂解酶（pectate lyase，PL）是新發(fā)現(xiàn)的一種降解果膠物質(zhì)從而導(dǎo)致果實(shí)軟化的酶，被認(rèn)為是通過(guò)分子改良果實(shí)硬度、阻止草莓果實(shí)軟化的優(yōu)秀候選基因（Yoder et al.，1993）。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)草莓硬度改良多采用傳統(tǒng)的雜交育種，基因工程主要是利用反義 RNA技術(shù)（Wooley &James，2001；Jimenez-Bermudez et al.，2002；Palomer et al.，2006），國(guó)內(nèi)外尚沒有利用雙鏈 RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)改良草莓硬度方面的報(bào)道。

本試驗(yàn)構(gòu)建了草莓PL基因的RNAi表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入到草莓植株中，為基因工程手段培育硬肉型草莓提供新種質(zhì)和育種材料開辟了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2008年12月～2009年7月在重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的豐香草莓無(wú)菌苗；大腸桿菌菌株DH5α、植物表達(dá)載體p2024（抗Kan，GFP標(biāo)記基因）、農(nóng)桿菌菌株LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。 pMD18-T載體及所有內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）、羧卞青霉素（Cb）、鏈霉素（Str）、利福平（Rfp）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PL基因片段克隆 根據(jù)已發(fā)表的草莓PL基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為U63550），利用Clustalx1.83和Genedoc2.0軟件，與其他物種的PL基因同源序列進(jìn)行分析比較，確定PL基因的保守片段。根據(jù)RNA干擾所需的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)要求，利用Primer Premier5.0，設(shè)計(jì)合成特異引物，上游引物 sp1：5’GTGGATTGTGTTCAAGCGTGACATGG 3’；下游引物 sp2：5’CAGCATAACCTGTTCCAATAAACC 3’。對(duì)草莓DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PL基因保守片段長(zhǎng)度382 bp的外顯子作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖（sense-PL，s-PL）及緊鄰的106 bp內(nèi)含子（intron）作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)，構(gòu)成PL基因RNA干擾載體的長(zhǎng)片段。

PCR反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃ 10s，55.3 ℃ 15 s，72 ℃ 30s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10min。擴(kuò)增完畢，1 %瓊脂糖電泳檢查。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 由于采用 Pfu高保真酶擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物3’端為平末端，膠回收PCR平末端產(chǎn)物，進(jìn)行3’- 末端加A反應(yīng)，然后連接到克隆載體pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含Amp 50mg·L-1的X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑選白色單菌落，PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆并確定方向，重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，獲得陽(yáng)性克隆載體pMD-siPL。

將pMD-siPL用HindⅢ/SalⅠ雙酶切，回收目標(biāo)片段siPL，與上述回收的r-PL進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)方法同上，挑選單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得RNA干擾克隆載體pMD-sirPL（圖1）。

用XbaⅠ/PmaCⅠ對(duì)pMD-sirPL雙酶切回收小片段，用Ecl136/XbaⅠ對(duì)表達(dá)載體p2024（圖2）雙酶切回收大片段，連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，對(duì)有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆，挑菌，在含Kan 100mg·L-1的LB培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒采用PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定。最后獲得RNA干擾表達(dá)載體p2024-sirPL（圖3）。

圖1 草莓RNA干擾克隆載體pMD-sirPL

圖2 植物表達(dá)載體p2024基因片段及酶切位點(diǎn)

1.2.4 草莓PL RNAi基因的轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含Rfp 100mg·L-1、Kan 100mg·L-1及 Str 100mg·L-1的 YEP平板上篩選培養(yǎng)，利用引物sp2/p44、sp4/p45對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定（引物p44、p45為植物表達(dá)載體上的一段堿基序列，序列是p44：ATGACGCACAATCCCACTATC；p45：ATCGCAAGACCGGCAACAG）。將鑒定正確的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落搖菌，用于草莓葉片轉(zhuǎn)化。

1.2.5 草莓外植體的轉(zhuǎn)化 對(duì)草莓的轉(zhuǎn)化采用葉盤法。選取豐香草莓無(wú)菌苗幼嫩葉片（培養(yǎng)25 d左右），切成0.5 cm×0.5 cm小塊，浸泡在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌液（OD600值0.6）中8～10min，用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，共培養(yǎng)2～3 d，至農(nóng)桿菌生長(zhǎng)剛好覆蓋傷口表面，轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基：MS+TDZ 2.0mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+Kan 45 mg·L-1+Cb 300mg·L-1；增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+Kan 45 mg·L-1+Cb 100mg·L-1；生根培養(yǎng)基：MS+Kan 45 mg·L-1+Cb 100mg·L-1。提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，利用引物sp2/p44、sp4/p45進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)干擾基因是否整合到草莓植株，并利用引物 p144/p256進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，排除假陽(yáng)性的可能（p256為干擾載體左邊界外一段引物序列：AACCCGGCAGCTTAGTTGCCGT；p144為干擾載體上一段序列：TTCAGGGAGTCACGTTATGAC）。

圖3 草莓RNA干擾載體p2024-sirPL構(gòu)建

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓PL基因的克隆與序列分析

用sp1/sp2引物對(duì)草莓提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，獲得488 bp左右的擴(kuò)增片段（圖4），與設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段基本一致。

凝膠回收PCR擴(kuò)增片段，并與pMD18-T載體連接，質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序，其結(jié)果與發(fā)表的草莓DNA序列（GenBank登錄號(hào)為AF339024.1）進(jìn)行對(duì)比，只有一個(gè)堿基不同，同源性達(dá)到99.8 %。利用引物 p240/sp2、sp1/p264（引物 p240、p264是克隆載體上的堿基序列，序列為 p240：AGCGGATAACAATTTCACACAGG；p264：GTAACGCCAGGGTTTTCCCA），對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD18- siPL進(jìn)行正反PCR驗(yàn)證，結(jié)果均有目標(biāo)片段。

用sp3/sp4對(duì)質(zhì)粒pMD18-siPL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得328 bp的PL基因RNA干擾載體的反向重復(fù)序列r-PL（圖5）。

圖4 PL基因長(zhǎng)片段克隆

圖5 PL基因RNA干擾載體的反向重復(fù)序列擴(kuò)增

2.2 植物RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

siPL與r-PL基因片段通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化，獲得的重組質(zhì)粒pMD18-sirPL經(jīng)過(guò)XbaⅠ/PmaCⅠ雙酶切鑒定，獲得預(yù)期的870bp目標(biāo)片段（圖6）。

草莓RNAi表達(dá)載體p2024-sirPL重組質(zhì)粒用引物sp2/p44進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得550bp左右的目標(biāo)片段（圖7），同時(shí)用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切質(zhì)粒p2024-sirPL，獲得1980bp的目標(biāo)片段（圖8），說(shuō)明RNA干擾載體構(gòu)建成功。

圖6 草莓克隆載體pMD18-sirPL酶切鑒定

圖7 草莓RNAi表達(dá)載體PCR檢測(cè)

2.3 農(nóng)桿菌PCR鑒定

將p2024-sirPL導(dǎo)入LBA4404，對(duì)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌液用兩對(duì)特異引物sp2/p44、sp4/p45分別能擴(kuò)增出約550bp和480bp的兩條片段，表明雙元質(zhì)粒載體p2024-sirPL已導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中（圖9）。

圖8 草莓RNAi表達(dá)載體酶切鑒定

圖9 含RNAi目的片段的農(nóng)桿菌PCR檢測(cè)

2.4 對(duì)草莓的轉(zhuǎn)化

經(jīng)農(nóng)桿菌液浸泡的豐香草莓葉盤，在進(jìn)行Kan篩選培養(yǎng)時(shí)，大量葉盤開始培養(yǎng)出少量愈傷，后變白死亡，少量葉盤愈傷可以繼續(xù)膨大，分化出綠色芽點(diǎn)（圖10）。通過(guò)在Kan篩選培養(yǎng)基上增殖生根培養(yǎng)，獲得2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（圖11），利用sp2/p44和sp4/p45兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出理想的目標(biāo)片段（圖12），利用引物p144和p256進(jìn)行PCR擴(kuò)增，排除了轉(zhuǎn)基因株系假陽(yáng)性（圖13），說(shuō)明外源RNA干擾PL基因已經(jīng)整合到草莓植株中。

圖10 草莓葉片Kan篩選培養(yǎng)獲得不定芽

圖11 草莓抗性芽增殖

圖12 轉(zhuǎn)基因草莓的PCR檢測(cè)

3 討論

RNA干擾是廣泛存在真核生物中，通過(guò)正反義RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象。RNAi具有特異、高效、放大的特點(diǎn)，雙鏈RNA的抑制作用要比單獨(dú)用反義RNA的抑制作用高出10倍以上（Davenport，2001）。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了草莓果膠裂解酶的RNA干擾載體，并已轉(zhuǎn)入草莓植株中，但對(duì)草莓果實(shí)硬度的影響還需進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因草莓生根，轉(zhuǎn)入大田栽培，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析后獲得。同時(shí)由于35 s是組成型啟動(dòng)子，基因的表達(dá)會(huì)在草莓的各個(gè)組織中得到表達(dá)，試驗(yàn)獲得的干擾載體是否會(huì)顯著影響草莓的生長(zhǎng)及代謝，還需要對(duì)轉(zhuǎn)基因草莓相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定后獲得結(jié)論。

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