結核分枝桿菌重組雙歧桿菌-ESAT-6-MPT64疫苗的構建及鑒定

曾莉蓉，李文桂

1.恩施州中心醫(yī)院消化內(nèi)科(湖北 恩施 445000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界近1/3的人感染過結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)，而且每年約有900萬新發(fā)臨床病例及300多萬死亡病例，我國每年新發(fā)耐多藥結核12萬例[1]。結核病已成為嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題?？ń槊?BCG)這一傳統(tǒng)疫苗的免疫保護效果不穩(wěn)定(0～80%)[2]。因此，研制安全有效的新型疫苗是控制結核病的重要途徑。ESAT-6和MPT64均為結核桿菌的早期分泌性蛋白，實驗證實二者可誘導特異性細胞免疫并刺激IFN-γ的產(chǎn)生[3]。研究提示，ESAT-6和MPT64均具有較強的細胞免疫活性，而在大多數(shù)BCG中又缺乏其編碼基因，因此二者有望成為基因疫苗的候選目的基因。Missich等通過實驗構建以雙歧桿菌為載體的重組質粒，為研究雙歧桿菌疫苗奠定了基礎。因此，本研究構建融合基因重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64，通過電轉化至雙歧桿菌，構建重組Bb-ESAT-6-MPT64疫苗，為預防結核病提供一種新型有價值的疫苗。

1 材料與方法

1.1材料MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、大腸埃希菌BL21由本實驗室保存； pGEX-1λ和雙歧桿菌分別由華西醫(yī)科大學微生物學教研室和武漢大學菌種保存中心贈送；基因組提取試劑盒、質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒等由上海生工公司提供；工具酶T4DNA連接酶、BamHI和EcoRI由Fermentas公司提供；結核分枝桿菌H37Rv標準株由重慶市肺科醫(yī)院提供。

1.2方法

1.2.1 引物設計 分別設計4條引物：P1：5’-CGGGATCCATGACAGAGCAGCAGTG-3’；P2:5’-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTGCGAACATCCCAGTGA-3’；P3：5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGTGCGCATCAAGATC-3’；P4：5’-TCTGAATTCGCCAAACTTGCCGAACAAGC-3’；其中P1為ESAT-6上游引物，5’端引入BamHI位點，P2為其下游引物；P3為MPT64上游引物，P4為其下游引物，P4的5’端引入EcoRI位點；P2、P3斜體部分為Linker(互補堿基對的疏水甘氨酸接頭)，4條引物由上海生工公司合成。

1.2.2 ESAT-6-MPT64融合基因的擴增及鑒定 首先以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，P1和P2為引物，PCR擴增ESAT-6-Linker(擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共28個循環(huán)，最后72℃延伸5 min)，以P3和P4為引物，同上述條件擴增Linker- MPT64，然后以二者的PCR純化產(chǎn)物為模板，P1和P4為引物，擴增ESAT-6-MPT64融合基因片段(擴增條件：95℃預變性4 min， 62℃退火50 s，余條件相同)，融合基因PCR產(chǎn)物采用上海生工公司的膠回收試劑盒純化， 1.2%瓊脂糖凝膠電泳對純化產(chǎn)物進行鑒定，送上海生工公司進行測序。

1.3大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭質粒pGEX-1λT的制備將質粒pGEX-1λT轉化至已制備好的BL21感受態(tài)細菌，接種至含有50μg/ml氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行增菌和篩選，用質粒抽提試劑盒小劑量抽提。

1.4 重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64的構建

1.4.1 目的基因及載體大片段的制備 二者PCR產(chǎn)物均進行BamHI及EcoRI雙酶切， 酶切產(chǎn)物由1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.2 連接 取載體2μl與目的基因8 μl置于10 μl連接體系，16℃過夜后，置70℃15 min，滅活T4DNA連接酶。連接產(chǎn)物接種至含有50 μg/ml氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行增菌和篩選，質粒抽提試劑盒抽提重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64。

1.5重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64的酶切鑒定

pGEX-ESAT-6-MPT64進行BamHI及EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物由1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組質粒中的目的基因送上海生工公司測序。

1.6重組Bb-ESAT-6-MPT64的鑒定將Bb菌種接種于100 ml含0.5 mol/L蔗糖的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，冰浴3 h；多次離心棄上清后取80 μl Bb和20 μl重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64于同一體系進行電穿孔(電穿孔參數(shù)：電壓1.2 kV、轉化時間5 ms、轉化次數(shù)2次)，轉化完畢后用含50 μg/ml氨芐青霉素的MRS瓊脂平板對rBb陽性重組子進行增菌和篩選，質粒抽提試劑盒提取重組質粒，以抽提的質粒為模板，P1和P4為引物進行PCR擴增(擴增條件同融合基因)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR純化產(chǎn)物后進行鑒定，送上海生工公司進行測序。

2 結果

2.1 PCR擴增pGEX-ESAT-6-MPT64融合基因圖1可見：擴增的目的條帶約1000 bp左右。送上海生工公司測序其長度為1020 bp，與預期的序列(288+45+687 bp)相同。

2.2 ESAT-6-MPT64融合基因及質粒pGEX-1λT的雙酶切鑒定圖2可見：ESAT-6-MPT64融合基因及質粒pGEX-1λT分別經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生約1020 bp和4.9×103bp的特異性條帶。

2.3重組質粒pGEX-ESAT-6-MPT64的雙酶切鑒定圖3可見：重組質粒經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生兩條分別約4.9×103bp和1020 bp的條帶。

1～2:ESAT-6-MPT64 PCR； 3:Marker

1:雙酶切的ESAT-6-MPT64融合基因；2:雙酶切的pGEX-1λT； 3: Marker

1:雙酶切的pGEX- ESAT-6-MPT64； 2:Marker

2.4 rBb-ESAT-6-MPT64疫苗的PCR鑒定圖4可見：以rBb中抽提的質粒為模板，P1和P4為引物，PCR擴增出約1020 bp的條帶，與融合基因ESAT-6-MPT64的序列完全相同。

1～4:PCR擴增產(chǎn)物； 5: DNA標志物

3 討論

Sorensen等[4]用SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)ESAT-6分子量為6 kD，編碼基因全長288 bp，可編碼95個氨基酸的蛋白質，ESAT-6是引起細胞免疫反應的重要免疫原。MPT64具有超氧化物歧化酶活性，其編碼基因長687bp，可編碼分子量為24KDa的蛋白質，MPT64具有CD8+T細胞表位，可誘導小鼠產(chǎn)生特異性細胞毒性T淋巴細胞，因此二者被選為新型疫苗構建的候選抗原。本研究采用的基因拼接法是將結核桿菌的早期分泌蛋白ESAT-6和MPT64的編碼基因用含45bp的疏水性甘氨酸多肽接頭連接，經(jīng)PCR擴增后送上海生工公司測序，其序列與預期的序列(288+45+687=1020 bp)一致，證實成功構建ESAT-6-MPT64融合基因。該多肽接頭具有一定的柔韌性和折疊性，不受內(nèi)切酶位點影響，而且在表達蛋白過程中能保持抗原的穩(wěn)定性，是一種操作簡便、具有良好的應用價值的實驗方法。pGEX-1λT是大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體，實驗將融合基因ESAT-6-MPT64克隆入pGEX-1λT，電轉化至大腸桿菌BL21，為構建重組雙歧桿菌疫苗奠定了基礎。

雙歧桿菌是人和哺乳動物腸道內(nèi)最主要的益生菌群，寄居于宿主腸道上皮，產(chǎn)生抗病原微生物、消除自由基、抑制腫瘤細胞和免疫調節(jié)等多種生理作用，臨床上主要用于消化道疾病的輔助治療[5]。郭志英等[6]已經(jīng)構建表達胞嘧啶脫氨酶基因和內(nèi)皮抑素基因的雙歧桿菌疫苗，這些疫苗對腫瘤的防治已有良好的效果。本研究所構建的重組雙歧桿菌- ESAT-6-MPT64疫苗有望成為預防結核病的一種新型有效的疫苗，其應用前景十分廣闊，但目前該疫苗仍處于研究階段，其安全性和有效性仍是值得關注的問題，因此多種動物的免疫保護力實驗需進一步深入。

[參考文獻]

[1] Kumar H，Malhotra D，Goswami S,et al.How far have we reached in tuberculosis vaccine development[J].Crit Rev Microbiol．2003,29(4):297-312.

[2] Ami Y，Izumi Y，Matsuo K，et al.Priming-boosting vaccination with recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin and a nonreplicating vaccinia virus recombinant leads to long-lasting and effective immunity[J].J Virol，2005，79(20)：12 871-12 879.

[3] 柏銀蘭，薛瑩，王麗梅，等．結核分支桿菌ESAT6-MPT64融合蛋白的構建及應用性初步研究[J].中華實用診斷與治療雜志，2009，23(4)：325-328.

[4] Sorensen AL，Nagai S，Houen G，et al.Purification and characterization of a low molecular mass T cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun，1995，63(5)：1 710-1 717.

[5] 李文桂,陳雅棠.雙歧桿菌生物學作用研究進展[J].地方病通報,2006,21(1):85-88.

[6] 郭志英,易成,王樹人,等.嬰兒雙歧桿菌胞嘧啶脫氨酶腫瘤靶向性基因治療系統(tǒng)的構建[J].中國肺癌雜志,2004,7(2):95-98.