二氫楊梅素聯(lián)合阿霉素抗乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的體外研究

周防震，張曉元，郭 勇

1.華南理工大學生物科學與工程學院(廣東 廣州 510006)

乳腺癌發(fā)病率高，居女性惡性腫瘤的首位[1]。阿霉素(Adriamycin, ADM)是在臨床上廣泛應用的一種化療藥物,具有抗瘤譜廣、 抗瘤作用強等特點, 特別是對乳腺癌有顯著療效[2],但在臨床腫瘤化療中有嚴重的不良反應，尤其是心臟毒性限制了阿霉素的臨床應用。因此努力尋找有效的藥物和最優(yōu)化的治療是當前研究的重點。二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)，化學名為3,5,7,3，4，5，-六羥基-2,3雙氫黃酮醇，是從藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物莖葉中提取的一種二氫黃酮醇化合物。研究表明DMY具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、止咳、廣譜抑菌、保肝護肝、降血糖、降血脂、增強人體免疫力等多種生理活性[3]。近年來其抗腫瘤作用日益引起人們的重視。已有資料顯示，DMY對乳腺癌MCF-7細胞、鼻咽癌HK-1細胞、肝癌Bel-7402細胞、白血病HL-60、K562細胞和肺癌H1299細胞[4～6]，都有較強的體外抑制作用。但DMY聯(lián)合化療藥物共同作用于癌細胞的體外作用研究尚未見報道。本研究旨在探討DMY是否可以通過與治療乳腺癌的常用藥物ADM聯(lián)合,提高ADM的抑癌作用，減少用藥量及減低其不良反應,以期為臨床提高乳腺癌的治療效果提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料乳腺癌細胞株MDA-MB-231由暨南大學生物工程研究所孫奮勇教授惠贈。注射用鹽酸阿霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。DMY(99%，HPLC)購自上海同田生物公司。DMEM、胎牛血清購自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜 (DMSO)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、 5%CO2溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 腫瘤細胞體外增殖抑制實驗 采用 MTT法[7]分別檢測DMY和ADM兩藥的單用和聯(lián)用的效應。實驗設(shè)實驗組、細胞對照組和空白對照組。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞稀釋成2.8×104/ml的單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔180 μl,空白組僅加入不含細胞的完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12 h后在藥物組中加入20 μl含不同濃度的DMY和ADM的完全培養(yǎng)基，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/ml和0.625、1.25、2.5 、5、10 μg/ml。每個濃度 5個平行孔,兩藥聯(lián)用比例為1∶1方案。實驗組亦給予不同濃度的含藥培養(yǎng)基,細胞對照組和空白組均給予完全培養(yǎng)基。當藥物作用48 h后,除去上清培養(yǎng)液,每孔中加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去含MTT的培養(yǎng)液，往每孔加入200 μl DMSO，輕輕振蕩，使細胞中形成的甲瓚結(jié)晶充分溶解，然后在酶標儀上檢測570 nm的光吸收值(A)，按下式計算藥物對腫瘤細胞增殖的抑制率(IR)=(1-實驗組A值/細胞對照組A值)×100%。以藥物濃度為橫軸，抑制率為縱軸，繪出增殖抑制曲線。以藥物濃度的對數(shù)與抑制率進行直線回歸并求出IC50。

1.3統(tǒng)計學分析應用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，運用Microcal Origin 6.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 DMY和ADM對MDA-MB-231的抗增殖作用比較DMY的DMSO溶液(16.7 μg/ml)的紫外掃描光譜圖見圖1A，在291 nm處有最大吸收峰，與文獻報道一致[3]。實驗中DMSO濃度<0.05%，該濃度對MDA-MB-231細胞的增殖沒有影響(數(shù)據(jù)未列出)。DMY或ADM單用48 h，隨著藥物濃度增加其效應均增加(圖1B、圖1C和表1)。DMY和ADM作用MDA-MB-231細胞48 h的IC50值分別為54.8 μg/ml和1.3 μg/ml。

2.2兩藥單用和聯(lián)用的效應按照中效方程式直線回歸計算出斜率(m)、相關(guān)系數(shù)(r)及中效濃度(Dm)，見表2。再計算出兩藥合用時出現(xiàn)不同效應時的合用指數(shù)CI，從而判斷兩藥在不同效應時各自所需藥物濃度之間相互作用，見表3。然后以效應(fa)為橫坐標，合用指數(shù)(CI)為縱坐標作圖，見圖2。隨著用藥劑量的增大，兩種藥物對腫瘤細胞MDA-MB-231增殖抑制效應也增強；兩藥合用作用于指數(shù)增殖期的MDA-MB-231細胞，當fa=0.75，即使75%左右的腫瘤細胞生長受抑制時，CI≈1，兩藥聯(lián)合效應相加；當fa<0.75, CI<1，兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應；當fa>0.75時，兩藥合用效應拮抗。兩藥在低濃度合用時對MDA-MB-231細胞可以產(chǎn)生較好的協(xié)同作用。抑制效應為0.70時，DMY與ADM同時應用，相對于它們單獨應用并取得相同效應時的劑量DMY減少了77.6%，而ADM減少了50.3%。

圖1 DMY的紫外吸收光譜及DMY或ADM單用對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用

表1 兩種藥物單用及合用在不同濃度(μg/ml)時的效應(fa)(n=6)

表2 DMY和ADM單用及合用時的斜率(m)、中效濃度(Dm)和相關(guān)系數(shù)(r)

表3 兩種藥物合用時在不同效應(fa)時的合用指數(shù)(CI)

圖2 DMY與ADM合用時的效應與合用指數(shù)曲線

3 討論

二氫楊梅素又名蛇葡萄素，廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中[9,10]，其中又以顯齒蛇葡萄幼嫩莖葉(民間稱“藤茶”)中含量最高，廣泛分布于我國長江流域以南，是一種古老的藥食兩用植物，長期作為類茶植物和中草藥在民間廣泛使用。在藤茶的春夏幼嫩莖葉中，黃酮類化合物占資源干重的35%～45%，其中二氫楊梅素又占資源干重的20%～30%，其主要活性成分二氫楊梅素(DMY)是目前國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的二氫黃酮類化合物中單體含量最高的植物[3]。藤茶中二氫楊梅素不僅含量豐富，且毒性極低[11]，具有開發(fā)為抗腫瘤藥物和化療藥物增敏劑的巨大潛力。已有研究表明二氫楊梅素能在體外抑制多種腫瘤細胞的生長，并能誘導細胞的凋亡，其作用機制可能為①誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡[12,13]；②抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14,15]；③抑制腫瘤血管生成[16]；④抑制端粒酶活性[17]等。本研究以人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細胞株MDA-MB-231為研究對象，結(jié)果表明二氫楊梅素具有抗MDA-MB-231細胞增殖的作用，作用48 h的IC50值為54.8 μg/ml，其抗癌作用機制值得進一步研究。

阿霉素作為一種周期非特異性廣譜抗癌藥物,對多種腫瘤均有明顯療效，已廣泛應用到乳腺癌的臨床化療中。但其對多個器官具有毒副作用(胃腸道反應、骨髓抑制、心臟毒性等)，特別是心臟毒性[18]；那么，在治療效應得到保證的前提下如何降低其使用濃度和毒副作用，是腫瘤防治的棘手問題。本研究結(jié)果表明，當fa≤0.75時兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應，即兩藥在低濃度合用對MDA-MB-231細胞可以產(chǎn)生較好的協(xié)同作用。抑制效應為0.70時，DMY與ADM同時應用，相對于它們單獨應用并取得相同效應時的劑量DMY減少了77.6%，而ADM減少了50.3%。ADM用藥劑量的減少導致藥物毒性的減弱并因此改善整體的治療效果，暗示DMY可能對化療藥物ADM具有增敏作用。但是，DMY是參與了細胞對ADM的攝取、降解、代謝發(fā)揮作用，還是本身或其降解代謝過程中的成分與ADM相互作用而發(fā)揮作用，還有待進一步證實?？梢钥隙ǖ氖?，DMY本身對MDA-MB-231有較好的抑制增殖效應，且可作為一種安全、有效、廉價的中藥，聯(lián)合ADM使用能夠降低ADM的劑量，因此，可以推測其作為臨床輔助ADM殺滅乳腺癌細胞，降低ADM的毒副作用會有較好的應用前景。

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