PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷中的調(diào)控作用及重組人紅細胞生成素預保護效應*

周文祥, 楊永麗, 楊 曉△, 夏章暉, 韓 敏, 聶祥智, 徐翠玲

1武漢市第一醫(yī)院腎內(nèi)科,武漢 430022

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科,武漢 430022

3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院口腔科,武漢 430077

4華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腎內(nèi)科,武漢 430030

急性腎臟缺血再灌注(I/R)損傷是休克、嚴重創(chuàng)傷及腎移植過程中一種常見的臨床病理生理現(xiàn)象,可導致急性腎衰竭(ARF)和移植腎功能喪失[1]。研究發(fā)現(xiàn),在人和動物模型的腎臟缺血性損傷中,有大量腎小管上皮細胞凋亡和壞死[2],而減少腎小管上皮細胞的凋亡可減輕缺血腎臟組織的損傷[3],表明腎小管上皮細胞的凋亡在腎臟的缺血性損傷中起了重要作用。研究顯示磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是一種重要的抗凋亡因子[4],它通過降低細胞凋亡的相關蛋白激酶Caspases家族、Bcl2等凋亡因子,在腎臟缺血再灌注損傷的動物模型中可以減少腎小管上皮細胞的凋亡從而發(fā)揮重要的保護作用。而糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)作為 Akt的一個底物,在心臟[5]、腦[6]等臟器的缺血再灌注損傷細胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用,但其是否在腎臟缺血再灌注損傷細胞凋亡中發(fā)揮效應尚未見報道。最近實驗發(fā)現(xiàn)重組人紅細胞生成素(rHuEPO)在心臟[7]、腎臟[8]等臟器的缺血再灌注損傷中能夠促進Akt的活性而減少細胞凋亡,從而發(fā)揮重要的器官保護作用[7]。本研究通過在腎小管上皮細胞(HK-2)缺血再灌注模型中利用特異性阻斷劑分別阻滯Akt、GSK-3β活性,觀察這些干預措施對HK-2細胞凋亡的影響,探討PI3K/Akt/GSK-3β通路對HK-2缺血再灌注損傷過程中細胞凋亡的調(diào)控作用,另外,觀察以rHuEPO預處理的HK-2缺血再灌注后細胞凋亡的變化,探討rHuEPO預保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

抗霉素 A 、鈣離子通道載體 A23187、LY294002、氯化鋰(LiCl)、MTT(美國 Sigma),AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒(南京凱基生物),兔抗人phospho-Akt Ser473多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人GSK-3β多克隆抗體、兔抗人phospho-GSK-3βSer9單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology),兔抗人Caspase 3多克隆抗體(美國Santa Cruz),重組人促紅細胞生成素(益比奧),沈陽三生公司惠贈。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗設計

HK-2細胞株由同濟醫(yī)學院免疫學系實驗室保存,以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。正常培養(yǎng)的HK-2細胞同步化24 h后更換含10 μ mol/L抗霉素 A 及 1 μ mol/L A23187[9-10]的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液孵育1 h,37℃預溫的PBS清洗之后換成正常含血清培養(yǎng)液,以模擬體內(nèi)細胞缺血再灌注損傷狀態(tài)。實驗分組如下:正常對照組、缺血再灌注(I/R)組、LY294002干預組、LiCl干預組、rHuEPO干預組、rHuEPO+LY294002雙干預組、rHuEPO+LiCl雙干預組,各干預組分別于缺血損傷前使用 LY294002(10 μ mol/L)、LiCl(20 μ mol/L)、rHuEPO(20 U/L)、rHuEPO+LY294002(20 U/L 、10 μ mol/L)、rHuEPO+LiCl(20 U/L 、20 μ mol/L)預孵育30 min,用抗霉素 A及 A23187誘導細胞缺血1 h后,更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.3 Western blot分析 Akt、GSK-3β和 Caspase 3 活性

以細胞裂解法提取蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并配平,樣本加入10%SDS-PAGE凝膠進行電泳,轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。一抗Akt Ser473(1∶1 000)、Akt(1 ∶1 000)、GSK-3β(1∶1 000)、GSK-3βSer9(1 ∶1 000)、Caspase 3(1 ∶1 000)和β-actin(1∶800)4℃孵育搖床過夜。二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,ECL化學發(fā)光試劑盒顯色、曝光、顯影、定影。用UVP凝膠成像掃描系統(tǒng)對膠片條帶行定量吸光度(A)測定。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

胰酶消化細胞,PBS清洗2次,將細胞重懸于300 μ L 結合緩沖液,分別加入 5 μ L Annexin Ⅴ試劑和PI混勻,室溫避光孵育15 min后上機。

1.5 MTT法檢測細胞存活率

細胞以每孔4 000個接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)、同步。各分組給予干預因素。分別加入MTT(終質(zhì)量濃度5 g/L),37℃孵育4 h,棄上清,加入二甲基亞砜150 μ L,室溫溶解 10 min,分光光度計 570 nm 波長讀取A值。每組設6個復孔,實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 缺血再灌注及阻斷劑LY294002、LiCl對 HK-2細胞凋亡率、存活率的影響

2.1.1 流式細胞儀檢測結果 正常對照組[(3.3±0.8)%]和I/R組[(15.2±1.4)%]細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),經(jīng)阻斷劑 LY294002預處理后缺血再灌注細胞的凋亡率上調(diào)為[(18.2±2.1)%],經(jīng)阻斷劑 LiCl預孵育后缺血再灌注細胞的凋亡率達到[(12.3%±0.8)%],與正常對照組和I/R組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),見圖1(A～D)。

2.1.2 M TT檢測結果 正常對照組(0.824±0.016)和I/R組(0.313±0.022)細胞 A值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),經(jīng)阻斷劑 LY294002預處理后缺血再灌注細胞的 A值下調(diào)為(0.201±0.026),經(jīng)阻斷劑 LiCl預孵育后缺血再灌注細胞的A值達到(0.468±0.030),與正常對照組和I/R組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),見圖2(A～D)。

2.2 rHuEPO預孵育對HK-2細胞缺血再灌注細胞凋亡率、存活率的影響

2.2.1 流式細胞儀檢測結果 與I/R組[(15.2±1.4)%]相比,rHuEPO干預組[(11.1±1.6)%]細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05);rHuEPO+LY294002雙干預組細胞凋亡率(13.4±1.9)%、rHuEPO+LiCl雙干預組細胞凋亡率(7.5±1.3)%,與rHuEPO干預組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均 P＜0.05),見圖1(E～G)。

2.2.2 MT T檢測結果 與I/R組(0.313±0.022)相比,rHuEPO干預組(0.574±0.016)A值明顯升高(P＜0.05);rHuEPO+LY294002雙干預組細胞A值(0.424±0.015)、rHuEPO+LiCl雙干預組細胞 A值(0.674±0.011)與rHuEPO干預組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),見圖2(E～G)。

圖1 流式細胞儀檢測各組HK-2細胞凋亡率Fig.1 Apoptotic ratio of HK-2 cells in each g roup examined by flow cytometry

圖2 不同干預措施對HK-2細胞存活力的影響(MT T法)Fig.2 Viability of HK-2 cells in each group measured by M TT

2.3 缺血再灌注對HK-2細胞Akt、GSK-3β和Caspase 3酶活性的影響

Western blot分析結果顯示:與正常對照組相比,再灌注0、0.5 h出現(xiàn)一過性的Akt活性水平上調(diào)和GSK-3β活性水平下調(diào),而再灌注1 h出現(xiàn)Akt活性水平下降和GSK-3β活性水平上升,再灌注2、4 h Akt活性明顯低于正常對照組,而GSK-3β活性明顯高于正常對照組(P＜0.05或P＜0.01),見圖3。

與正常對照組比較,再灌注0、0.5 h時均未見Caspase 3活性變化,而再灌注1 h時出現(xiàn)Caspase 3活性的升高,再灌注 2、4 h時 Caspase 3活性均明顯高于正常對照組(均P＜0.01),見圖3。

2.4 阻斷劑 LY294002、LiCl對 HK-2 細胞 Akt、GSK-3β 和Caspase 3活性的影響

圖3 缺血再灌注對HK-2細胞內(nèi)Akt、GSK-3β及Caspase 3活性的影響Fig.3 Effects of I/R on activities of Akt,GSK-3β and Caspase 3 in HK-2 cells

與I/R組相比,阻斷劑LY294002干預后,細胞內(nèi)Akt活性水平降低,GSK-3β活性升高;阻斷劑LiCl干預后,細胞內(nèi)Akt活性水平升高,GSK-3β活性降低。I/R組HK-2細胞內(nèi)Caspase 3活性水平較正常對照組顯著上調(diào)(P＜0.05);阻斷劑LY294002干預后HK-2細胞內(nèi)Caspase 3活性較I/R組顯著增高(P＜0.05);而阻斷劑 LiCl干預組HK-2細胞內(nèi)Caspase 3活性水平較I/R組明顯下降(P＜0.05),見圖4。

2.5 rHuEPO預孵育對Akt、GSK-3β和Caspase 3活性的影響

與I/R組相比,rHuEPO干預組HK-2細胞內(nèi)Akt活性水平顯著上調(diào)、GSK-3β活性水平顯著下調(diào)(均P＜0.05);與rHuEPO干預組相比,rHuEPO+LY294002雙干預組細胞內(nèi)Akt活性水平下調(diào)、GSK-3β活性水平上調(diào),而 rHuEPO+LiCl雙干預組細胞內(nèi)Akt活性表達上調(diào) 、GSK-3β活性水平下調(diào)(均P＜0.05),見圖4。

rHuEPO干預組與I/R組相比,Caspase 3活性水平顯著下降(P＜0.05)。與 rHuEPO組相比,rHuEPO+LY294002雙干預組細胞內(nèi)Caspase 3活性水平升高、rHuEPO+LiCl雙干預組細胞內(nèi)Caspase 3活性水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),見圖4。

3 討論

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是介導細胞存活的一條經(jīng)典通路[7],活化的PI3K通過3-磷酰化磷酸肌醇酯和磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)共同作用而激活Akt,Akt的激活是通過其氨基酸殘基位點Ser473和Thr308的磷酸化實現(xiàn)的。研究表明PI3K/Akt在心臟[7,11]、腎臟[8]等缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的保護作用。

圖4 不同組別HK-2細胞內(nèi)Akt、GSK-3β及Caspase 3相對活性Fig.4 T he relative activities of Akt,GSK-3β and Caspase 3 in each g roup of HK-2 cells

糖原合成酶激酶 3β[12](glycogen synthase kinase-3p,GSK-3β)是Akt重要的下游因子之一[12],GSK-3β廣泛地表達于機體的各種組織和細胞中,其肽鏈結構中富含絲氨酸/蘇氨酸殘基。Tyr216殘基被磷酸化后其活性被激活,而Ser9殘基被磷酸化后其活性被抑制。最新發(fā)現(xiàn)GSK-3β在多種信號傳導過程中起關鍵作用,它不僅通過激活糖原合成酶調(diào)節(jié)細胞糖代謝從而調(diào)控細胞能量代謝過程,更重要的是在細胞的生長、分化、突變和細胞凋亡等生命活動中也具有重要的調(diào)控作用。研究表明,在多種正常組織細胞以及多數(shù)類型的腫瘤細胞中,GSK-3β的激活可以進一步激活細胞凋亡的相關蛋白激酶,如BAX[13],c-jun[14],Caspases家族[15]等,從而誘導細胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn),在心肌[11,16],腦[6]等缺血再灌注中GSK-3β的磷酸化水平降低,活性增強,促進了缺血再灌注損傷臟器中細胞的凋亡。在腎臟也發(fā)現(xiàn)有GSK-3β的表達,其在慢性腎炎的發(fā)展中起到了重要作用[15]。但GSK-3β是否在腎臟缺血再灌注損傷腎小管上皮細胞的凋亡中起作用尚未見報道。

Caspase的活化是凋亡發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié),Caspase級聯(lián)效應一旦激活,意味著凋亡的發(fā)生不可避免。近年來研究多表明在心肌的缺血性損傷中激活 Caspase 3的同時也發(fā)現(xiàn)有 GSK-3β的激活[11],當GSK-3β上游的信號轉(zhuǎn)導分子受到抑制導致GSK-3β激活時,就會促進 Caspase 3的激活,從而造成細胞凋亡。

本實驗用抗霉素A及A23187[9-10]制作 HK-2細胞的缺血再灌注損傷模型,模擬體內(nèi)缺血再灌注狀態(tài)。用 PI3K/Akt阻斷劑 LY294002、GSK-3β阻斷劑 LiCl分別阻斷 Akt、GSK-3β活性,以觀察Akt、GSK-3β是否在HK-2的缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用,并觀察PI3K/Akt是否通過GSK-3β起作用。在實驗中,首先觀察到缺血再灌注損傷誘導HK-2細胞凋亡率增加并細胞活力下降,細胞內(nèi)Akt(Ser473)及GSK-3β(Ser9)水平一過性升高后也呈時間依賴性下調(diào),Caspase 3活性呈時間依賴性上調(diào),表明HK-2細胞缺血再灌注過程中Akt活性下調(diào)而 GSK-3β活性升高。使用PI3K/Akt阻斷劑LY294002阻滯Akt活性后,細胞內(nèi)Caspase 3活性進一步上調(diào)且細胞凋亡率升高,說明Akt在減少缺血再灌注細胞凋亡過程中發(fā)揮保護作用。研究發(fā)現(xiàn)Akt活性阻滯的同時伴有GSK-3β(Ser9)表達水平進一步下調(diào),說明Akt活性的抑制可促進GSK-3β活性的上調(diào)。當使用 GSK-3β阻斷劑 LiCl阻滯GSK-3β活性后,Caspase 3活性下調(diào),細胞凋亡率下降,說明GSK-3β活性的上調(diào)在缺血再灌注損傷HK-2細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。因此推論,正常細胞內(nèi)Akt活性的存在,使其下游因子GSK-3β活性水平受到抑制,保護細胞免于凋亡;而缺血再灌注損傷抑制了Akt活性,從而降低了其對下游因子GSK-3β蛋白的磷酸化作用,GSK-3β活性的升高參與了缺血再灌注損傷誘導腎小管上皮細胞的凋亡。

最近研究顯示rHuEPO預孵育對心臟[7]、腎臟等[8]臟器的缺血再灌注損傷有保護作用,并且揭示了部分的作用機制。Sharples等[8]研究發(fā)現(xiàn)rHuEPO可使Akt(Ser473)表達水平上調(diào),降低Caspase 3,8,9活性,促進Bcl-XL表達,從而減少細胞的凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)rHuEPO干預可使細胞凋亡率下降、細胞活力提高,同時伴有 Akt(Ser473)、GSK-3β(Ser9)水平上調(diào),Caspase 3活性降低。較單純rHuEPO干預相比,rHuEPO+LY294002雙干預后,細胞凋亡率升高,GSK-3β活性水平提高,Caspase 3酶活性上調(diào);rHuEPO+LiCl雙干預后,細胞凋亡率下降,Caspase 3酶活性下調(diào),由此推論,rHuEPO通過促使上調(diào)Akt活性,抑制其下游因子GSK-3β的活性,從而減輕了缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡。

綜上所述,缺血再灌注損傷抑制了HK-2細胞的Akt信號傳導通路,從而激活了其下游因子GSK-3β、Caspase 3的活性,可能是其導致HK-2細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路之一。rHuEPO能夠提高Akt活性水平,抑制GSK-3β活性,使HK-2在缺血再灌注損傷中形成了耐受,為其成為潛在治療缺血性損傷的藥物提供了實驗依據(jù)。GSK-3β的激活可以誘導 HK-2的凋亡,但其確切的下游機制有待進一步探討。

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